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LONZA內(nèi)毒素檢測－LAL 試劑 （點擊進(jìn)入）
動態(tài)濁度鱟試劑使用說明 概述：
鱟試驗是一種最靈敏和專一的內(nèi)毒素檢查方法，它是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的產(chǎn)物，通常稱為熱原。鱟試驗的原理是內(nèi)毒素與LAL反應(yīng)可形成易于分辨的凝膠。簡單、經(jīng)濟的的鱟試驗使得它已廣泛應(yīng)用于半成品、原材料以及藥品、醫(yī)療器械和生物制品等產(chǎn)品的檢查。美國藥典的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法和美國FDA指南為有效驗證鱟試驗法代替兔熱原法提供了標(biāo)準(zhǔn)方法。
借助電腦和微孔平板儀或試管儀，可以進(jìn)行動態(tài)比濁法試驗，可精確地檢測出已設(shè)定的濁度。設(shè)定濁度的反應(yīng)時間與檢品中的內(nèi)毒素的量成反比，因此未知檢品中的內(nèi)毒素水平是通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較來確定的。用動態(tài)測量，λ是標(biāo)準(zhǔn)曲線中的最低點。
生物原理
Frederick Bang觀察到細(xì)菌導(dǎo)致美洲鱟血管內(nèi)的血液凝結(jié)。在協(xié)作研究中，Levin和Bang發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致凝結(jié)現(xiàn)象的因素存在于鱟的阿米巴細(xì)胞中或循環(huán)血液細(xì)胞中，熱原（細(xì)菌內(nèi)毒素）觸發(fā)濁度和凝膠形成酶促反應(yīng)。
美國FDA終產(chǎn)品檢測指南：
美國食品與藥品管理局在1987年發(fā)布了一份準(zhǔn)則，通知生產(chǎn)人用藥品和生物制品、獸用藥品和醫(yī)療器械的廠商，F(xiàn)DA認(rèn)為有必要用于驗證鱟試驗作為終產(chǎn)品的內(nèi)毒素檢測方法的程序，那些遵照鱟試驗準(zhǔn)則的廠商將被認(rèn)為符合CGMPs有關(guān)規(guī)定。非經(jīng)腸道藥品的通用內(nèi)毒素限值是5個內(nèi)毒素單位（EU）每公斤劑量，但鞘內(nèi)藥品的限值是0.2EU/Kg醫(yī)療器械浸取液不得超過0.5EU/ml；與腦脊髓接觸的器械的限值為0.06EU/ml。必須根據(jù)FDA的鱟試驗指南（1987）的補充規(guī)定（1991）“臨時指導(dǎo)原則”進(jìn)行動態(tài)濁度分析。
鱟試劑：凍干的濁度試劑含有用單價和二價陽離子加以穩(wěn)定的緩沖過的鱟阿米巴細(xì)胞溶解物。靈敏度，λ是參考美國標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素EC-5標(biāo)定的，用EU/ml標(biāo)示。它是EU/ml表示的RSE的最低濃度并在標(biāo)準(zhǔn)條件下產(chǎn)生凝膠。
復(fù)溶：將試劑瓶在一堅固的表面輕彈使瓶中的鱟試劑粉末落到瓶底。小心地移開蓋子釋放真空，避免接觸污染。殘留在膠塞上的少量試劑是無關(guān)緊要的。在使用前立即用5.2毫升的無熱原水復(fù)溶試劑，用移液棒將水直接加入瓶中，不立即使用時用無熱原封口膜蓋住瓶口，輕輕攪動直到鱟試劑溶解于無色溶液中。如果封口破損或出現(xiàn)顏色或混濁則將它們丟棄。
貯存：凍干的鱟試劑在熱的條件下還是相對穩(wěn)定的，但還是應(yīng)存放在2-8℃下；避免長時間放置在高于25℃的溫度條件下。已復(fù)溶的鱟試劑在間歇使用過程中最好放在一冰冷的表面上或2-8℃的冰箱里存放24小時以內(nèi)，否則在復(fù)溶并凍結(jié)后將其存放在-20℃以下，可存放28天，鱟試劑只能凍融一次。
ACC可提供E.coli內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）用于復(fù)核試劑的靈敏度、驗證產(chǎn)品檢測方法和制備抑制對照管（陽性水和陽性產(chǎn)品對照），參考每一批CSE的分析證明中關(guān)于效價、復(fù)溶和貯存的信息。該批產(chǎn)品必須另外訂購合適的CSE。
必須用LAL檢查用水（無LAL活性）復(fù)溶鱟試劑和制備樣品、對照管和內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，該批產(chǎn)品必須另外訂購合適的LAL檢查用水。
警告和預(yù)防
警告：濁度法試劑只用于體內(nèi)診斷，使用時須小心因為其毒性仍不為人所知。
正確應(yīng)用該檢測方法要求嚴(yán)格遵守推薦程序中的所有項目，LAL原始記錄中必須包括陽性對照以檢測抑制條件。所有與樣品接觸的材料或檢測材料必須是無熱原的，玻璃器皿必須經(jīng)有效除熱原，（我們的經(jīng)驗是標(biāo)示已滅菌和處理的塑料制品是無熱原的。那些不能經(jīng)高溫滅菌的材料或銷售時沒有無熱原標(biāo)簽的材料應(yīng)小心檢測其是否含內(nèi)毒素）。
樣品的采集和制備
所有與樣品或檢測試劑接觸的材料必須是無熱原的，在任何時候都要使用無菌技術(shù)。由于鱟試劑-內(nèi)毒素的反應(yīng)是與pH值有關(guān)的，樣品-鱟試劑的混合物應(yīng)產(chǎn)生6.5-8.0的pH值。如果需要調(diào)節(jié)pH值，使用無內(nèi)毒素TRIS緩沖液，不要隨便調(diào)節(jié)未緩沖溶液的pH值因為ACC配方已經(jīng)緩沖過。
產(chǎn)品干擾
每一樣品的檢測方法必須經(jīng)過驗證證明無明顯的干擾，抑制通常與濃度有關(guān)，可用LAL檢查用水稀釋來克服干擾。抑制的普遍來源包括1）干擾酶介反應(yīng)的和2）改變內(nèi)毒素（陽性）對照的分散性。
最大有效稀釋：美國食品和藥品管理局規(guī)定經(jīng)靜脈給藥的藥品的內(nèi)毒素限值為5EU/kg，鞘內(nèi)藥品為0.2EU/ml。但對于一些簡單的藥品也采用特殊限值，這些限值可以用來確定稀釋的范圍以克服干擾問題而不會超過限定的內(nèi)毒素濃度，最大有效稀釋（MVD）是按照以前提到的文件和其它藥典中提供的公式來計算的。
對于有公布限值的藥品，MVD可按下列公式計算：
MVD＝ 內(nèi)毒素限值×產(chǎn)品效價
靈敏度
例如，環(huán)磷酰胺的內(nèi)毒素限值是0.17EU/mg，如果使用最低內(nèi)毒素水平為0.05EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線來檢測效價為20 mg/ml的產(chǎn)品，MVD等于1:68,這樣, 環(huán)磷酰胺可最大稀釋到1:68以解決潛在的抑制(一份樣品比68份無熱原水)
用動態(tài)法進(jìn)行干擾（抑制/增強）檢測試驗是用已知濃度的內(nèi)毒素強化或稀釋樣品并根據(jù)供應(yīng)商的說明重復(fù)兩管檢測其峰值回收率，這個試驗要求用RSE或CSE制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線（參閱CSE的分析化驗證明），標(biāo)準(zhǔn)曲線至少應(yīng)包括三個RSE或CSE濃度，還應(yīng)包括另一標(biāo)準(zhǔn)品以分辨在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的每一個10倍稀釋的增長。曲線必須符合“試驗特征”中所述的標(biāo)準(zhǔn)。
選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點做干擾檢測，例，范圍為5至0.05EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線的陽性產(chǎn)品對照濃度是0.5EU/ml。（見日常檢測）
強化的藥品的內(nèi)毒素含量均值，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線時，如果在±50%以內(nèi)則認(rèn)為無干擾，回收率不在
±50%以內(nèi)表明樣品受到干擾，用無熱原水繼續(xù)稀釋樣品直到獲得有效的回收率，但不能超過MVD。另一種檢測干擾的方法是4l內(nèi)毒素回收率在±50%以內(nèi)。
動態(tài)濁度檢測程序
可在有以下功能的試管或微孔平板儀上用KTA2作動態(tài)濁度分析：A）可測量相對于時間的光密度值的變化的檢測系統(tǒng)B）微電腦和相應(yīng)的軟件通過線性回歸分析信息。
每個試驗應(yīng)包括樣品或稀釋的樣品或產(chǎn)品、陽性產(chǎn)品對照管，包含設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線的一系列稀釋或陽性水對照管和一陰性對照管，至少重復(fù)兩管檢測，按照自動內(nèi)毒素測量系統(tǒng)提供的指導(dǎo)進(jìn)行操作。
方法：無菌地將0.1ml的每個樣品移到微孔平板的每個孔底，在準(zhǔn)備鱟試劑的添加的同時將平板至少預(yù)熱10分鐘；否則遵照儀器供應(yīng)商的說明。然后用配量器快速將0.1ml的鱟試劑加入每個孔中，先加陰性對照，最后加最高的內(nèi)毒素濃度。如果平板儀不能自動混合溶液，輕拍平板側(cè)面幾次并及時啟動定時觀察，期望的監(jiān)控階段結(jié)束后，啟動結(jié)果的分析程序。
要求的試劑/材料但不供應(yīng)：
微孔平板，可任意處理并已除熱原
玻璃稀釋試管，無熱原
獨立包裝的移液器，滅菌移液針頭
滅菌移液棒，獨立包裝，用無菌吸頭自動吸取液體
旋渦混合器
平板儀或試管儀
日常檢查
用雙對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線作日常檢查是最有效的；每個檢查的標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)包括至少三個內(nèi)毒素濃度，重復(fù)兩管檢測，例如5，0.5和0.05EU/ml。對于半成品或原材料的檢測，從5至0.005 EU/ml的四個數(shù)量級的標(biāo)準(zhǔn)曲線可能更合適。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較好的一致性時，可制作存檔曲線，按《臨時鱟試驗指南》中所述，使用三次檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線；若使用存檔曲線，陽性水對照在該曲線上的固定值平均數(shù)誤差須在±25%范圍。
陽性產(chǎn)品對照（PPC）應(yīng)含有等于標(biāo)準(zhǔn)曲線中點的內(nèi)毒素濃度，例如上面介紹的0.5EU/ml。參考臨時鱟試驗指南來選擇PPC，PPC的內(nèi)毒素濃度平均值必須落在±50%的相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)，確證污染的測定時應(yīng)做內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品系列。ACC推薦的有效的強化技術(shù)是直接將內(nèi)毒素加入檢品中強化，用這一技術(shù)制備陽性產(chǎn)品對照的過程是在加入顯色試劑前將10μl的5.0 EU/ml的CSE加入到已含100μl檢品的微孔平板的孔中。
結(jié)果
內(nèi)毒素濃度的計算
在整個檢測過程中，試管儀或微孔平板儀監(jiān)測吸光度的增加，儀器記錄吸光度明顯增加所需的時間，通常是0.050至0.200 光密度單位，這一時間稱為反應(yīng)時間。儀器軟件自動形成每一標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)時間與它相應(yīng)的內(nèi)毒素濃度的雙對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線的特征并評估確定該分析是否有效。下面列示了一標(biāo)準(zhǔn)系列和樣品產(chǎn)品中的0.5EU/ml內(nèi)毒素的回收率。
代表性線性分析
樣品 CSE（EU/ml） 平均反應(yīng)時間（秒） 回收率（EU/ml）
STD1 50.0 337
STD2 5.0 493
STD3 0.5 801
STD4 0.05 1400
STD5 0.005 3025
ACG.SPL1 --- **** <0.005
AVG.PPC 0.5 822 0.706(141%)
回歸等式：Log(y)=-0.236Log(x)+2.879
相關(guān)系數(shù)：g = -0.991
在這個例子中，每個樣品（SPL）的陽性對照（PPC）的內(nèi)毒素回收率表明無抑制。
陰性對照的內(nèi)毒素濃度應(yīng)明顯低于最低的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度。
如果相關(guān)系數(shù)的絕對值大于0.980，可用一多項回歸模式來描述標(biāo)準(zhǔn)曲線。多項回歸模式的計算是為使用WinKQCL、Biolise或此類軟件的用戶準(zhǔn)備的。請參考有關(guān)軟件手冊和以下描述多項式回歸模式的部分。
多項回歸模式
如果線性相關(guān)系數(shù)大于或等于0.980，多項回歸模式適用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。
注：多項標(biāo)準(zhǔn)曲線不能用于初次質(zhì)量檢測。根據(jù)管理條例，對于這種檢測FDA只接受線性回歸模式。
上面的例子用四個項（五個標(biāo)準(zhǔn)）進(jìn)行分析，將得出以下結(jié)果：
多 項 分 析
樣品 CSE（EU/ml） 平均反應(yīng)時間（秒） 回收率（EU/ml）
STD1 50.0 337
STD2 5.0 493
STD3 0.5 801
STD4 0.05 1400
STD5 0.005 3025
AVG.SPL1 --- **** <0.005
AVG.PPC 0.5 122 0.445(89%)
匹配的回歸等式:
Log(y)=0.0031*Log(x)4+0.001*Log(x)3 +0.011*Log(x)2-0.216*Log(x)+2.837
線性相關(guān)系數(shù): g = -0.991
程序的局限性
如果不出現(xiàn)用可接受的稀釋（參考MVD計算）或樣品預(yù)處理，如緩沖，可消除的抑制或增強因素，樣品可用鱟試驗方法檢測，如果鱟試驗方法不能在最大有效稀釋的濃度內(nèi)進(jìn)行驗證，則不能用鱟試驗代替美國藥典熱原檢測方法。
試驗特征
斜率：在用于確定內(nèi)毒素水平的濃度范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率必須經(jīng)過驗證，至少應(yīng)檢測三個內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)三管檢測。相關(guān)系數(shù)g應(yīng)大于或等于0.980的絕對值。
動態(tài)濁度的質(zhì)量控制過程
遵照FDA鱟試驗指南關(guān)于終產(chǎn)品檢測的凝膠法質(zhì)量控制過程包括增加理論濃度在±50%范圍內(nèi)的陽性產(chǎn)品對照。標(biāo)準(zhǔn)曲線必須有一個≤-0.980的相關(guān)系數(shù)。
用ACC的濁度法試劑驗證過的檢測方法不需要用KTA2重新驗證。
當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較好的一致性時，可制作存檔曲線，使用三次檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線；若使用存檔曲線，陽性水對照在該曲線上的固定值平均數(shù)誤差須在±25%范圍。
期望值
濁度法鱟試劑是根據(jù)美國標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素EC-5來標(biāo)定的,因此靈敏度用EU/ml來表示。如果濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)可對內(nèi)毒素進(jìn)行定量。生物來源的水或材料如果提純未完成，可能含有可測量水平的內(nèi)毒素。確定的內(nèi)毒素含量應(yīng)與內(nèi)毒素限值比較來評估其特征。
使用適當(dāng)?shù)臈l件，ACC的有效范圍從100-0.001 EU/ml。影響標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的選擇的因素包括 A） 分析儀器的參數(shù)，B）回歸模板的選擇，和C）分析試劑和實驗室用具的質(zhì)量
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