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1 方法、機理及影響因素 1.1 應(yīng)用的方法目前，美國藥品食品管理局（FDA）承認(rèn)3種鱟試劑檢測細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法，即凝膠（gelclot）法、生色（chromogenic）法和動態(tài)濁度（keniticturbidimetry）法［2］。近年來較新的方法有水箭電泳免疫法（測殘余蛋白）、酶聯(lián)免疫吸附法（測殘余酶）。后者所需鱟試劑僅相當(dāng)于凝膠法的1/100，且靈敏度更高，抗干擾能力更好。《中國藥典》1995年版只采用凝膠法。凝膠法是將等體積的供試品溶液和新配制的鱟試劑（TAL）溶液在試管中混勻，一般各0.1 ml，（37±1）℃反應(yīng)（60±2）min。如果被檢測的溶液不含干擾凝集反應(yīng)的因素，且其含有內(nèi)素素濃度等于或大于所用鱟試劑的靈敏度（λ）時，就會在試管中顯示陽性反應(yīng)，即形成凝膠；否則呈陰性反應(yīng)，即呈澄明溶液或輕度混濁，視內(nèi)毒素的濃度而定［1］。該反應(yīng)極其靈敏，凝膠形成速率與內(nèi)毒素濃度成正比，并受溫度、反應(yīng)物中Ca2 /Mg2 離子濃度和pH等因素的影響［3］。同樣，《中國藥典》2000年版也只采用凝膠法。 淘金者.taojz.com 1.2 凝膠法鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)的機理見圖1。
圖1 凝膠法鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)的機理（略） 2 影響細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的因素 2.1 檢品的干擾pH值、離子濃度以及某些干擾成分，都會影響到檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性，得到所謂“假陽性”或“假陰性”結(jié)果。只有證實檢品對凝集反應(yīng)無干擾之后，檢查的結(jié)果才是可信的。判斷檢品是否有干擾要做檢品的干擾實驗。 2.2 鱟試劑的非特異性內(nèi)毒素不是唯一能激活鱟試劑凝集系統(tǒng)的物質(zhì)，還有其他物質(zhì)可以通過G因子這個“旁路”激活鱟試劑的凝集系統(tǒng)。因此鱟試劑并不是專一對內(nèi)毒素反應(yīng)的試劑。由旁路反應(yīng)產(chǎn)生的陽性結(jié)果稱細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的“假陽性”。 3 特殊值的確定 3.1 藥品的內(nèi)毒素限值（L）藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是一種限度實驗，首先必須確定供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值。當(dāng)供試品含內(nèi)毒素低于這個限值時，按規(guī)定給藥途徑用藥，就不會引起致熱原反應(yīng)；相反就有可能引起熱原反應(yīng)［1］。藥品細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定的方法有3種。
3.1.2 根據(jù)熱原檢查的兔劑量計算L=K/M，M規(guī)定的給藥途徑，藥品的家兔注射劑量，以ml/kg，mg/kg，μ/kg等表示；K為規(guī)定的給藥途徑；臨床無任何不良反應(yīng)的內(nèi)毒素閾值，以Eu/kg表示。靜脈（包括im，ip，sc，ia）：5.0 Eu/kg；放射性藥品：2.5 Eu/kg；鞘內(nèi)：0.2 Eu/kg。
3.2 藥品的最大有效稀釋（MVD）做藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時，當(dāng)品種的L值與所選用的鱟試劑靈敏度（λ）相等時，若經(jīng)干擾實驗證實無干擾，可以直接檢查。但許多藥品的L值往往大于鱟試劑的靈敏度（L＞λ），在這種情況下，若直接檢查，得到陽性結(jié)果并不能說明該藥品的內(nèi)毒素含量超過限值。因此，當(dāng)L＞λ，需要對檢品作適當(dāng)?shù)南♂專♂尩谋稊?shù)不能超過一個有效的限度，這就是“最大有效稀釋”，用MVD表示。其計算公式如下：MVD=L/λ。 4 重要的實驗――預(yù)實驗 4.1 鱟試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核實驗鱟試劑是一種有生物活性的試劑，其穩(wěn)定性受多種因素的影響，藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查又是關(guān)系到藥品安全性的重要檢查項。因此各國的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法都規(guī)定：每批鱟試劑在用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查前都必須對該批試劑標(biāo)示的靈敏度進行復(fù)核。當(dāng)復(fù)核的靈敏度值λ0在標(biāo)示值λ的0.5~2.0λ范圍（即0.5λ≤λ0≤2.0λ），方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并且要按標(biāo)示值使用。 4.2 檢品的干擾實驗 4.2.1 干擾實驗的目的判斷某個品種在某種濃度狀態(tài)下是否宜作細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，就需要對其作干擾實驗。要求至少對每個廠家連續(xù)生產(chǎn)的3~5個批號（不包括亞批）的供試品進行干擾實驗，若鱟試劑的來源以及供試品的配方有變化或生產(chǎn)工藝改變時，須重復(fù)進行干擾實驗［6］?！睹绹幍洹返募?xì)菌內(nèi)毒素檢查法及FDA關(guān)于鱟試劑的準(zhǔn)則規(guī)定，用鱟試劑方法檢查任何一種藥品的內(nèi)毒素含量之前，至少要做3批成品的干擾實驗，如果鱟試劑的來源或制造工藝改變，或藥品的生產(chǎn)工藝、處方、成分改變，要重做干擾實驗；如果藥品的特殊組分的來源或鱟試劑的批號改變，要用陽性產(chǎn)品對照來復(fù)檢鱟試劑方法對這一產(chǎn)品的檢查有效性。 4.2.2 干擾實驗的原理干擾實驗在《美國藥典》的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中稱為抑制或增強實驗。其原理是比較鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)在水溶液中進行和在檢品中進行的差異。也就是比較反應(yīng)在不同介質(zhì)中進行的差異無差異即無干擾，有差異即有干擾。 4.2.3 干擾實驗的方法干擾實驗是由兩部分實驗組成：其一是鱟試劑與內(nèi)毒素在水溶液中的反應(yīng)實驗，這部分與鱟試劑的靈敏度復(fù)核實驗完全相同。其二是鱟試劑與內(nèi)毒素在檢品溶液中的反應(yīng)實驗，也就是在檢品中加入相應(yīng)量的內(nèi)毒素（或者說用檢品的溶液來稀釋內(nèi)毒素），用來做鱟試劑靈敏度的“復(fù)核”，比較鱟試劑在不同介質(zhì)中對內(nèi)毒素的“靈敏度”是否一致。 4.2.4 陽性產(chǎn)品對照用SMVD復(fù)溶鱟試劑，然后加入2 λ濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液與之反應(yīng)，若反應(yīng)結(jié)果為陰性，說明檢品對檢查有抑制作用。若反應(yīng)結(jié)果為陽性，說明檢品對檢查無抑制作用，但并未能表示無增強作用。 淘金者論文范文中心 5 應(yīng)用前景 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法作為一種新技術(shù)載入藥典，成為一種法定的藥檢方法，反映了藥典標(biāo)準(zhǔn)水平、藥檢技術(shù)水平的提高，標(biāo)志著一個國家制藥工業(yè)水平及藥品質(zhì)量的提高。隨著歷史的發(fā)展，必將有更多國家的藥典收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。它具有方法多樣化、自動化、微量化的特點。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法所具有的優(yōu)點表明它比家免熱原檢查法更適應(yīng)現(xiàn)代制藥工業(yè)的發(fā)展。它可以應(yīng)用于藥檢，也可以用于藥品生產(chǎn)質(zhì)量控制、臨床診斷及其它領(lǐng)域。該法用于藥品成品的檢查，屬于一種事前控制的質(zhì)控手段，對提高藥品質(zhì)量，避免造成藥品成批報廢有重要意義；在臨床上可作為快速診斷革蘭氏陰性細(xì)菌感染的疾病的一種輔助方法，但不能區(qū)分病原體。其它在食品衛(wèi)生、環(huán)境保護、電子工業(yè)（如超純水的檢查）等領(lǐng)域也涉及到細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的應(yīng)用。 參考文獻： ?。?］ 黃清泉,夏振民.藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的實驗設(shè)計［J］.中國藥學(xué)雜志,1997,32(2):72. ?。?］ 王茂林.鱟試劑法檢查熱原的應(yīng)用范圍［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,1990,10(4):41. ?。?］ 高國政,顏錦.pH值影響細(xì)菌內(nèi)毒素測定的實驗室研究［J］.中國藥學(xué)雜志,1998,18(3):162. 淘金者論文范文中心 ［4］ 郭錄平.淺談影響鱟試驗的因素［J］.中國藥學(xué)雜志,1996,31(3):187. :淘金者論文范文是你生活，學(xué)習(xí)的好助手 ?。?］ 國家藥典委員會.中國藥典，Ⅱ部［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：附錄86. ?。?］ 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中國藥典，Ⅱ部［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1995：附錄XXⅢ. |
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