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購買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 www.effectnews.cn |
簡介T 細(xì)胞在免疫細(xì)胞介導(dǎo)的靶向腫瘤治療中起到重要作用。使用體外活化擴(kuò)增的 T 細(xì)胞進(jìn)行過繼性免疫療法正在成為臨床環(huán)境中治療癌癥的有力工具。多篇報道指出了使用含有各種細(xì)胞因子(如 IL-2, IL-7,和 IL-21)可用于 T 細(xì)胞的活化和擴(kuò)增。血清補充劑(如人自體血漿)是 T 細(xì)胞體外活化與擴(kuò)增的重要添加劑。在本研究中,我們利用白細(xì)胞介素 -2(IL-2),抗人 CD3 抗體和抗人 CD28 抗體展示了康寧 88- 581-CM 培養(yǎng)基對人 T 細(xì)胞體外活化與擴(kuò)增的應(yīng)用。同時研究了使用含有或不含 2% 人自體血漿的康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基體外培養(yǎng)人 T 細(xì)胞的相關(guān)結(jié)果。 材料和方法外周血單核細(xì)胞(PBMC)的制備
外周血單核細(xì)胞使用康寧淋巴細(xì)胞分離液 (LSM)(Corning Cat.No.25-072-Cl),按照產(chǎn)品使用說明提供的操作方法,從人源新鮮的外周血中分離獲得。獲得的外周血單核細(xì)胞用不含鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液 (PBS) 洗滌三次,離心去除多余的淋巴細(xì)胞和少量的殘留的紅細(xì)胞。離心參數(shù)設(shè)置如下: 第 1 次: 室溫,1500 rpm/min,10min;第 2 次:室溫,1200 rpm/min,10min;第 3 次:室溫,1000 rpm/min,10min。 人 T 細(xì)胞的體外擴(kuò)增 通過免疫磁珠分選 CD3+ T 細(xì)胞,使用 EasySep™人 T 細(xì)胞分離試劑盒 (STEMCELL Technologies Cat. No. 17951) 從新鮮 PBMC 中分選人 CD3+ T 細(xì)胞。將 CD3+ T 細(xì)胞 (1×106 個細(xì)胞 / mL) 懸浮于含有 1µg/mL 抗人 CD28 抗體和 200 IU/mL IL-2 (Corning Cat. No. 354043) 的含有或不含自體血漿的Corning 88-581-CM 培養(yǎng)基中。將含有 2×106 個細(xì)胞的細(xì)胞懸液接種到用 5µg/mL 抗人 CD3 抗體預(yù)包被的 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (Corning Cat. No. 3516) 中的一個孔中,并在 37℃,5% CO2 的恒溫的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 天。在第 4 天至 14 天,添加含有或不含人自體血漿的 200 IU/mL IL-2 的新鮮 Corning 581- 88-CM培養(yǎng)基將細(xì)胞密度維持在5×105 至2×106 個細(xì)胞/mL 之間。每天觀察細(xì)胞形態(tài),培養(yǎng)至14 天, 離心收獲細(xì)胞。 表型分析 在第 0 天和第 14 天收集 T 細(xì)胞樣品,利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行鑒定分析。本研究中, 我們通過檢測兩組T 細(xì)胞表面標(biāo)記物(CD3+/CD8+、CD4+/CD45RO-)的表達(dá)水平來評價體外擴(kuò)增后的 T 細(xì)胞質(zhì)量。具體操作參考 BD 提供的流式細(xì)胞檢測標(biāo)準(zhǔn)流程, 不同標(biāo)記的細(xì)胞表面標(biāo)記物抗體, 按 1:1 抗體 /105 細(xì)胞的比例,4℃避光孵育 15min 后,PBS 洗滌后利用 300uL PBS 重懸細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行表性分析,同型對應(yīng)抗體作為對照。
結(jié)果將人 T 細(xì)胞在含有和不含 2% 人自體血漿的康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周。培養(yǎng)過程中出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)簇與血漿的有無并無直接關(guān)系。圖 1 的結(jié)果表明補充含有 2% 血漿的細(xì)胞比在不含血漿的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞形成更多的細(xì)胞團(tuán)簇。 含有 2% 自體血漿的康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基 當(dāng)人 T 細(xì)胞在含有 2% 血漿的康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)時,到第 10 天時細(xì)胞會迅速增殖 100 倍至超過 1 億個細(xì)胞。 第 14 天收獲時,細(xì)胞已經(jīng)擴(kuò)增了 250 倍約 6 億個細(xì)胞。相比不加血漿的康寧 圖 1. 培養(yǎng)第 10 天細(xì)胞形態(tài) (A) 含有 2% 自體血漿的康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞。 (B) 不含血漿的康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞。 。 圖 2. 使用含有 2% 人自體血漿的康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基的細(xì)胞生長和倍數(shù)擴(kuò)增。不含自體血漿的 Corning® 88-581-CM 培養(yǎng)基為了評估不含自體血漿的康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基的擴(kuò)增結(jié)果,我們將其與競爭品牌 G 同時進(jìn)行 T 細(xì)胞的無血清體外擴(kuò)增,并比較其擴(kuò)增結(jié)果。當(dāng)T 細(xì)胞在不額外添加血漿的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第 14 天時, 細(xì)胞產(chǎn)量(~2×108 個細(xì)胞)和擴(kuò)增倍數(shù)(~100 倍;如圖 3)兩者沒有顯著差異。接下來我們評估了康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基在特定 T 細(xì)胞亞型擴(kuò)增中的應(yīng)用。CD8+T 細(xì)胞能夠殺死癌細(xì)胞和病毒同時產(chǎn)生細(xì)胞因子,足夠數(shù)量的初始 T 細(xì)胞對于病原體的連續(xù)應(yīng)激反應(yīng)是必不可少的。使用康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基培養(yǎng)后,CD8+T 細(xì)胞和初始 T 細(xì)胞比例分別為 90.9% 和 5.3%,高于競爭品牌 G 培養(yǎng)基(分別為 89.1% 和 1.4%;如圖 4)。
圖 3. 細(xì)胞在康寧 88-581-CM 和競爭品牌 G 培養(yǎng)基中無血清培養(yǎng) 14 天增殖能力的比較。
圖 4. 細(xì)胞在康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基和競爭品牌 G 培養(yǎng)基擴(kuò)增 T 細(xì)胞的表型分析。CD3+/CD8+ 為CD8+T 細(xì)胞;CD+/CD45RO- 為初始 T 細(xì)胞。此外,我們也評估了擴(kuò)增 2×108 個 T 細(xì)胞所需的培養(yǎng)基總成本。康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基的成本非常具有優(yōu)勢。在中國地區(qū),其僅為競爭品牌 G 培養(yǎng)基成本的三分之一。 結(jié)論
康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基可以在無血漿或低自體血漿條件下成功活化和擴(kuò)增 T 細(xì)胞,獲得高表達(dá)的CD8+ T 細(xì)胞和初始 T 細(xì)胞。雖然康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基與競爭品牌 G 的培養(yǎng)基之間在 T 細(xì)胞增殖能力上沒有顯著差異,但在效應(yīng) T 細(xì)胞的比例上有明顯優(yōu)勢,且成本更低,為研究人員提供了更好的選擇。 保修/ 免責(zé)聲明:除非另有規(guī)定,所有產(chǎn)品僅供研究使用。不適用于診斷或治療程序。不適用于人類??祵幧茖W(xué)從未聲稱這些產(chǎn)品可以用于臨床或診斷應(yīng)用。
Corning® KBM 581 淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基
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