一、 實驗目的
通過本實驗學習PCR反應的基本原理，掌握PCR的基本操作技術以及瓊脂糖凝膠電泳技術。
二、 實驗原理
PCR用于擴增位于兩端已知序列之間的DNA區(qū)段，即通過引物延伸而進行的重復雙向DNA合成?；驹砑斑^程如下：
PCR循環(huán)過程中有三種不同的事件發(fā)生：（1）模板變性；（2）引物退火；（3）熱穩(wěn)定DNA聚合酶進行DNA合成。
1.變性：加熱使模板DNA在高溫下（94-95℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。
2.退火：在體系溫度降至37-65℃，模板DNA與引物按堿基配對原則互補結合，使引物與模板鏈3’端結合，形成部分雙鏈DNA，即退火階段。
3.延伸：體系反應溫度升至中溫72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下，利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向復制出互補DNA，即引物的延伸階段。
上述3步為一個循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25～30個循環(huán)后DNA可擴增106～109倍。
典型的PCR反應體系由如下組分組成：DNA模板、反應緩沖液、dNTP、MgCl2、兩條合成的DNA引物、耐熱DNA Taq聚合酶。
三、實驗材料及相關試劑
基因組DNA，基因特異性引物，PCR擴增相關試劑，等
四、實驗步驟
1．模板DNA的抽提：實驗一所得的水稻基因組DNA。
2．PCR操作 (在冰上操作)：
（1）PCR反應混合液的配制：反應體系25 µL, 在無菌的0.2 mL離心管中按下列操作程序加樣：
| 反應物 | 加樣順序 | 體積/µL | 終濃度 |
| ddH2O | 1 | 17.3×n | |
| 10 x Buffer | 2 | 2.5×n | 1 x |
| 25 mmol/L MgCl2 | 3 | 1.5×n | 1.5 mmol/L |
| 10 mmol/L dNTP | 4 | 0.5×n | 200 µmol/L |
| 10 µM上游引物 | 5 | 1×n | 0.4 µmol/L |
| 10 µM下游引物 | 6 | 1×n | 0.4 µmol/L |
| DNA Taq聚合酶 | 7 | 0.2×n | 1 U |
（2）將反應混合液混勻, 然后每個PCR管中分裝24 µL反應混合液，再加1 µL模板DNA，最后加1滴石蠟油，防止水分蒸發(fā), 然后稍離心。
