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八十年代以來由人類免疫缺陷病毒(HIV)感染而引起的艾滋病(AIDS)因其嚴(yán)重的危害性而受到人們高度重視，力爭早期診斷和尋求有效治療是防止其廣泛傳播的關(guān)鍵所在.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)具有敏感、特異和快速的特點，是檢測病毒、評價病情進(jìn)展和探討發(fā)病機理的有效工具. 一、HIV的基因結(jié)構(gòu) HIV的基因結(jié)構(gòu)與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒基本相同，為RNA雙分子，其單鏈RNA分子由9749個核苷酸組成，有3組共9個基因。第一組為逆轉(zhuǎn)錄病毒共同的基因，即gag、pol和env基因，及側(cè)翼的長末端重復(fù)順序(LTR)等.其中前三者為病毒的結(jié)構(gòu)基因，編碼病毒蛋白，而基因組兩端的LTRs，不編碼任何蛋白，可起始其它病毒基因的表達(dá)，無種屬特異性.第二組為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的基因，即tat、rev和nef基因，可以增強或抑制其它基因的表達(dá).第三組為特有基因，負(fù)調(diào)控病毒的感染性，成熟或釋放，即vif、vpu和vpr.HIV有十分高的遺傳變異率，它是一個多態(tài)性病毒，從不同的AIDS患者體內(nèi)分離出的病毒結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出一定的差異，事實上，獨立分離到的HIV-1和2彼此都不相同，這是由于病毒傳播過程中突變，缺失或插入引起的，高度變異區(qū)在env基因內(nèi)，相當(dāng)于gp120的五個區(qū)段，gag和pol基因較少變異，因此，只有選擇病毒基因組中高度保守區(qū)域作為目的基因加以擴增，才能有效地檢測所有HIV的變異性.目前已知HIV有兩個型，HIV-1是從歐洲和美洲分離毒株的總稱，亞洲地區(qū)的流行株也基本上為HIV-1，HIV-2是從西非的妓女分離的毒株. 二、PCR在鑒定HIV感染中的意義 HIV?？梢饾摲腥?，但仍具有傳染性，整合的病毒基因組在每個細(xì)胞中僅以很低的DNA拷貝數(shù)存在，因此，需要建立一個敏感而又特異的HIV檢測方法.傳統(tǒng)的檢測途經(jīng)很多，包括外周血抗原測定，病毒分離和逆轉(zhuǎn)錄酶法等，但均費時費力，穩(wěn)定性也差.核酸雜交雖有一定的特異性，敏感性卻較低，利用原位雜交發(fā)現(xiàn)AIDS患者僅有104～105之一的細(xì)胞有含有HIV-1DNA，實際上遠(yuǎn)不至此.聚合酶鏈反應(yīng)被稱為無細(xì)胞的分子克隆技術(shù)(cell-free molecular cloning)，自1987年即被用于AIDS的研究中.Ou利用針對HIV-1LTR，gag和env基因的三對引物對HIV血清學(xué)和病毒分離均陽性與血清學(xué)陽性，但病毒分離陰性的男性同性戀者進(jìn)行外周血單個核細(xì)胞(PBMC)前病毒DNA序列的測定，發(fā)現(xiàn)前者的陽性率為100%，后者也可達(dá)60%，對照組則均為陰性，因此提出PCR可以作為病毒分離的替代方法.Imagawa將PCR與其他幾種傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較，結(jié)果在分離出HIV-1前，具有血清陽轉(zhuǎn)的4例男性中3例可用PCR檢測出外周血淋巴細(xì)胞中g(shù)ag基因的存在，這種陽性反應(yīng)可發(fā)生在血清陽轉(zhuǎn)前38～42個月，而在得出PCR陽性結(jié)果前，無一例分離出病毒，因而認(rèn)為，對仍從事高?；顒?如吸毒、同性戀等)的血清陽性個體，PCR能有效地發(fā)現(xiàn)HIV感染者的存在.此外，臨床上AIDS患者常出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，而在許多血清學(xué)陽性個體的腦脊液(CSF)中卻未分離出HIV-1，因而難以確定病毒的侵襲范圍.利用PCR技術(shù)已經(jīng)證實了CSF中存在著前病毒DNA和游離病毒RNA序列，而且RNA量似乎比DNA更為豐富.至于CSF中病毒序列的存在是否與神經(jīng)系統(tǒng)的損害有關(guān)，目前仍存在不同意見，但至少無癥狀感染者CSF中HIV-1的存在對闡明與HIV-1相關(guān)的神經(jīng)損害具有重要意義. 研究表明，HIV感染的女性所生的嬰兒中有30～59%可在宮內(nèi)、分娩過程或產(chǎn)后哺乳期感染該病毒，但由于嬰兒體內(nèi)存在來自母體的抗體且可持續(xù)15個月左右，同時又缺乏檢測IgM型抗體的手段等原因，使得傳統(tǒng)方法在鑒定新生兒是否感染方面受到限制，及時地對新生兒作出診斷，對于其獲得早期治療具有積極的意義.PCR技術(shù)所需標(biāo)本量少，對新生兒、嬰兒的診斷尤為適用.Roger用PCR對血清陽性母親所生的23例兒童從新生兒開始進(jìn)行外周血前病毒DNA的跟蹤監(jiān)測，結(jié)果表明，在后來發(fā)展為AIDS的7例兒童中，有5例在新生兒期即存在病毒序列，而血P24抗原卻檢測不到;具有AIDS非特異表現(xiàn)者，也有4/14在新生兒期呈陽性PCR反應(yīng);由這些母親所生的健康兒童和陰性對照組則均為陰性，說明本方法的特異性和靈敏性極高.Soeiro進(jìn)一步用PCR法證實了宮內(nèi)感染的存在，采集了23例AIDS或血清陽性母親的流產(chǎn)兒組織，進(jìn)行PCR擴增，并作原位分子雜交比較，結(jié)果有7例用PCR檢測到HIV-1DNA，而原位雜交只有1/8流產(chǎn)兒組織呈陽性反應(yīng). 由于HIV具有高度的變異性，使得AIDS的治療顯得頗為棘手，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)體外病毒分離株對AZT易感性降低.Richman利用一對寡核苷酸引物對接受AZT治療者的外周血進(jìn)行PCR擴增，得到的535bp的片段中含有與AZT耐藥性有關(guān)的4個逆轉(zhuǎn)錄酶基因突變位點，而且突變數(shù)目與耐藥程度成比例，因此，PCR能有效地監(jiān)測毒株的耐藥性.利用env基因的高度變異性，對該基因特異性擴增后進(jìn)行病毒分型，對于監(jiān)測毒株的變異及分子流行病學(xué)的研究具有十分積極的意義;對分娩健康嬰兒的AIDS女患者HIV基因的擴增及分析，也有利于探討母嬰垂直傳播的條件及毒株的特點，從而研制出有效的疫苗. 由此，我們可以看出，PCR技術(shù)在鑒定HIV感染方面具有重要的意義，它可檢出抗體出現(xiàn)前的感染者，篩選新個體，確定病毒類型和耐藥毒株，區(qū)分兒童感染的時間，并可作為AIDS的預(yù)后指征. 三、HIV感染的定量PCR研究 目前檢測體內(nèi)HIV活性的方法有限，雖然循環(huán)血CD4+細(xì)胞計數(shù)、血清P24抗原、新喋呤、β2-MG等曾用來指示HIV感染時病毒的水平，其敏感性和特異性均受限，定量培養(yǎng)又費時昂貴.定量PCR是HIV感染中直接測定病毒本身的最佳途徑.早期首先采用有限稀釋法，即將所采取的HIV感染者標(biāo)本進(jìn)行梯度稀釋后分別進(jìn)行PCR擴增，以反應(yīng)陽性的最大稀釋度 作為病毒水平，缺點是不能給出病毒的絕對拷貝數(shù).后有作者用含有已知量的HIV序列的質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行系列PCR反應(yīng)，然后以擴增產(chǎn)物量對初始模板量得出標(biāo)準(zhǔn)曲線;待測標(biāo)本用相同體系擴增后從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得所加標(biāo)本量，從而推算出樣品中HIV的感染水平.但在反應(yīng)過程中既使嚴(yán)格控制實驗條件和操作步驟，同一份標(biāo)本在不同的試管內(nèi)也存在著擴增的差異，即所謂的“試管效應(yīng)”，因此，為了使PCR定量客觀標(biāo)準(zhǔn)化，又引入了內(nèi)參照來消除這種差異，如利用HLADQα基因與HIV感染標(biāo)本用各自的引物在同一管中擴增，前者模板量已知，且作一系列梯度管，后者以一恒定的未知量參與反應(yīng)，后用前者擴增的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算后者的初始模板水平，但缺點是這種內(nèi)參模板的擴增效率與HIV的擴增效率不同. 從理論上講，在PCR反應(yīng)中應(yīng)存在著這樣一種關(guān)系，即Y=S(1＋e)n，Y指擴增后拷貝數(shù)，S是初始拷貝數(shù)，n代表循環(huán)次數(shù)，e指擴增效率.由于PCR對反應(yīng)條件和初始模板量高度敏感，因此e值變異很大，可在0～1范圍內(nèi)波動，近年來在克服上述各種方法缺點的基礎(chǔ)上而建立起來的競爭性定量PCR(QC-PCR)對HIV感染的定量分析已顯示出廣泛前景.其基本原理是人工設(shè)計與待測靶序列基本相同但能夠區(qū)分的突變體(包括缺失、插入和限制性酶切位點突變)作為競爭模板，并以不同比例與一定量的靶序列共同混合于同一反應(yīng)體系中，在相同引物介導(dǎo)下，兩種模板共同擴增，當(dāng)某一管中兩種擴增產(chǎn)物的量相等時，該管中的已知競爭模板濃度即為靶序列的初始模板濃度.Piatak以HIV的高度保守區(qū)域gag基因作為靶序列，用含有HIV基因組的質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物用PCR方法合成一內(nèi)部缺失80bp的gag片段，然后將此片段重組克隆后作為競爭模板.與待測標(biāo)本共同擴增后的產(chǎn)物由于分子量大小不同，可用瓊脂糖、聚丙酰胺凝膠電泳及密度掃描等計數(shù)結(jié)果，從而確定起始模板數(shù).該方法在目前而言是一種相對客觀而準(zhǔn)確的定量途經(jīng)，但其缺點是每測一份標(biāo)本需設(shè)系列管，比較麻煩，造價昂貴，試劑盒難于推廣. 最近美國AcuGen System研制了一種新的封閉式定量PCR系統(tǒng)，將生化、計算機和光電技術(shù)相結(jié)合，并采用專用試劑，從擴增的DNA直接做定量數(shù)據(jù)的讀取和分析，免除了傳統(tǒng)的電泳，照相等步驟，也排除標(biāo)本污染的可能性.設(shè)備由三部分組成，定量讀數(shù)器，擴增儀和計算機.其定量模式是根據(jù)能量轉(zhuǎn)換原理設(shè)計.在PCR擴增到一定程度時，加入一信號試劑，即萬能信號雙鏈體，它是由互補的寡核苷酸鏈組成，該寡核苷酸鏈分別由具有熒光能量轉(zhuǎn)換的供受者加尾修飾，連接在擴增引物的5'端，這種連接穩(wěn)定了信號雙鏈體，并建立了熒光能量轉(zhuǎn)換反應(yīng)，因為穩(wěn)定結(jié)合在一起的雙鏈體接受光后會發(fā)生能量轉(zhuǎn)換.當(dāng)以后的循環(huán)開始后，新生鏈開始產(chǎn)生，引起這種結(jié)合的引物雙鏈體變?yōu)閱捂?，接受光的能力下降，發(fā)生能量轉(zhuǎn)換的全部瓦解.熒光信號隨著循環(huán)次數(shù)的減少而被測量出來，以計算特定擴增片段的不斷累積量.目前國內(nèi)已有這種HIV檢測試劑盒出售，但由于設(shè)備及試劑均很昂貴，限制了它的廣泛應(yīng)用. 對體內(nèi)的病毒水平作準(zhǔn)確的定量分析，有助于對感染過程的各期作病因性分析，觀察藥物的療效，更好地指導(dǎo)治療.Bagnarelli用QC-PCR法檢測33例HIV感染者外周血標(biāo)本中病毒的拷貝數(shù)及轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果提示，病毒拷貝數(shù)與疾病進(jìn)展和CD4+淋巴細(xì)胞計數(shù)減少之間存在著與高度相關(guān)性，在疾病的各個階段均存在著HIV-1結(jié)構(gòu)基因的特異性轉(zhuǎn)錄和復(fù)制.有趣的是，盡管隨著疾病的進(jìn)展，病毒血癥不斷加重，但AIDS患者的個別感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性僅中等度地高于無癥狀感染者.此外，血漿中HIV-1基因組RNA定量，似乎是更為可靠和敏感的病毒活性的標(biāo)志.另有作者用定量PCR發(fā)現(xiàn)AIDS患者血漿中HIV-1數(shù)量明顯高于無癥狀血清陽性者，在每8～14周口服ddT劑量≥6.4mg/Kg.天的患者，其血漿HIV-1顆粒數(shù)量明顯降低，提示循環(huán)中游離病毒量與HIV-1的感染性滴度、CD4<400/mm3、HIV相關(guān)癥狀的存在和藥物治療密切相關(guān)，也說明PCR是監(jiān)測這些指標(biāo)的有效方法. 在HIV-1感染過程中，與免疫功能密切相關(guān)的細(xì)胞因子有無變化，是探討其免疫致病機理的重要一環(huán)，由于細(xì)胞因子在血清中水平很低，僅達(dá)Pg水平;血清半衰期短，約數(shù)分到數(shù)小時，而且分泌后很快與受體結(jié)合，使得臨床標(biāo)本的檢測成為困難.Fan利用PCR法分析了HIV-1感染者外周血細(xì)胞因子mRNA水平的變化，以β-actin作為內(nèi)參照，對各種細(xì)胞因子mRNA水平定量，可精確至10個拷貝的mRNA.結(jié)果表明，血清陽性的男性同性戀者PBMC中IFN-γmRNA水平升高，而IL-2mRNA水平卻下降，隨著病情進(jìn)展，這種變化更為明顯;CD4和CD8細(xì)胞中這些細(xì)胞因子mRNA水平也不相同;所有細(xì)胞因子在HIV感染后期表達(dá)均下降. 四、PCR的相關(guān)問題 1.模板的選擇和提取 艾滋病患者和HIV感染者的血液和各種體液中均含有一定量的病毒.目前作為診斷和研究的標(biāo)本多采用外周血，因為HIV是一種嗜T細(xì)胞性病毒，其中模板量豐富且易保存，因此從PBMC較易得到HIVDNA，另外血漿中存在的游離病毒也可以作為提供模板的原料.HIV也常侵犯單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞和皮膚的郎格罕氏細(xì)胞，所以也可采取除血液外的腦脊液和表皮組織提取模板來擴增，以探討其致病機理.由于艾滋病多由性傳播引起，因此唾液和精液也存在較低量的病毒顆粒，而且已用PCR發(fā)現(xiàn)雖然精液中存在HIV-1DNA，但精子細(xì)胞中卻缺如，用PCR對這兩種體液中病毒的檢出對疾病的預(yù)防有重要意義. 傳統(tǒng)PCR中模板的提取包括細(xì)胞裂解，酸氯仿抽提蛋白，乙醇沉淀核酸等過程，步驟繁多.現(xiàn)在多數(shù)作者傾向采用粗制細(xì)胞裂解液或冰凍血液直接進(jìn)行擴增.Albert將HIV感染者PMBC在含有SDS.tritonX-100和蛋白酶K的裂解液中處理后，直接將此混合物用于擴增，證明其非常適合于PCR過程.濾紙干血斑標(biāo)本(DBS)的應(yīng)用使標(biāo)本采集更加簡便，它采用指血，特別適合于圍產(chǎn)期篩查和高危人群的分子流行病學(xué)大面積調(diào)查.Cassol測定了在模擬現(xiàn)場條件下保存DBS標(biāo)本的穩(wěn)定性和反應(yīng)性，證實經(jīng)過凍融、于22℃下保存22周或37℃和60%濕度下孵育7天的這種標(biāo)本的DNA完整并適用于擴增分析，且低HIV拷貝數(shù)的DBS于上述條件下保存，PCR反應(yīng)性也未降低.對AIDS患者和HIV感染者DBS標(biāo)本的驗證實驗，均產(chǎn)生較強的PCR信號. 2.選擇合適的引物，改良條件提高敏感性. 這一點在許多文獻(xiàn)中均已報道主要原則為:1.減少設(shè)計引物的序列與HIV相關(guān)病毒或人細(xì)胞DNA的同源性;2，選擇的引物要盡量處于HIV基因組的高度保守區(qū)，如gag、env、pol、tat基因中的某些核苷酸序列;3.盡量保證引物3'端的堿基與模板的匹配，引物內(nèi)無一級結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)不能有互補序列.常用的引物及位置見表1. 其次，PCR反應(yīng)過程中多對引物的應(yīng)用漸趨增多，由于HIV的高度變異，單純一對引物的擴增結(jié)果已被認(rèn)為不夠確切，至少需要兩對引物擴增才能鑒別陽性反應(yīng)的存在.事實上，多對引物的應(yīng)用可明顯提高PCR的敏感性，Albert通過4對引物的應(yīng)用，使100%的HIV感染者得到陽性擴增.套式引物PCR也能明顯提高HIV感染檢測的敏感性，并被用于AIDS患者病毒水平的定量研究中.Bagasra為使HIV感染的定量分析更加準(zhǔn)確化，以細(xì)胞本身作為反應(yīng)管，采用原位PCR，擴增完整細(xì)胞中的基因片段，發(fā)現(xiàn)外周血中感染的PBMC頻率為0.1-13.5%，明顯高于普通PCR;結(jié)合免疫磁珠分離技術(shù)，發(fā)現(xiàn)某些疾病進(jìn)展者其CD4細(xì)胞比例增高，其HIV感染的CD4細(xì)胞水平也較高. 3.結(jié)果的檢測 標(biāo)本中模板得到有效的擴增后，必須客觀地檢測出來，一般多采用瓊脂糖凝膠電泳后目測觀察特異性擴增條帶，必要時可采用聚丙酰胺凝膠電泳以提高分辨率.但有時這種方法達(dá)不到足夠的敏感性，Keller報道了一種改良的探針檢測法，引物與HIV-1gag基因互補，且5'端以生物素標(biāo)記，擴增的產(chǎn)物既作為標(biāo)本又作為探針;再設(shè)計一種“捕獲”探針，其序列正好位于兩引物之間，但不與引物重疊，這樣避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn).生物素化的PCR擴增產(chǎn)物在微量滴定板中被捕獲，然后再與鏈霉親和素一過氧化物酶結(jié)合物和四甲基聯(lián)苯胺底物反應(yīng)，用比色法測定，這種方法靈敏性和特異性大大提高.在QC-PCR中，為精確算出病毒拷貝數(shù)，將dNTP中的一種用放射性核素標(biāo)記，經(jīng)過30～50個循環(huán)后，PCR擴增產(chǎn)物即具有放射性.回收電泳膠帶，分別測定二者的放射活性，根據(jù)不同濃度突變模板與標(biāo)本的混合和擴增產(chǎn)物的放射性強度之間的關(guān)系，可以精確算出標(biāo)本中DNA拷貝數(shù).但由于使用同位素存在半衰期短，危險等缺點，雖可精確定量，卻限制了PCR的實際應(yīng)用，現(xiàn)也采用PCR-EIA(酶免疫法)來對HIV感染水平定量，來克服使用同位素的缺點.另外目前有些實驗室中采用的電泳后EB染色凝膠的密度掃描也可借鑒. PCR檢測HIV中常用的引物和探針
總之，PCR術(shù)在HIV感染研究中的應(yīng)用已獲良好效果，在目前亞洲地區(qū)HIV感染增長速率十分迅猛的情況下，開展此項技術(shù)的研究對于我國艾滋病的防治有著十分重要的現(xiàn)實意義. |
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