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lonza 特殊 無(wú)血清 培養(yǎng)基http://bitebo.com/a/gb2312/gongsixinxi/shichanghuodong/2013/0331/5024.html
ELISA法檢測(cè)乙肝兩對(duì)半影響因素分析與對(duì)策
南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院 黃道連
關(guān)鍵詞: ELISA 乙肝兩對(duì)半 影響因素 分析
ELISA法廣泛用于乙肝兩對(duì)半檢測(cè)。但ELISA測(cè)定中影響因素較多，有些因素會(huì)導(dǎo)致結(jié)果假陽(yáng)性或假陰性,本文就ELISA測(cè)定乙肝兩對(duì)半的影響因素及對(duì)策報(bào)作如下討論:
1． 樣本采集與處理的影響
1.1標(biāo)本嚴(yán)溶血及混有紅細(xì)胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈，殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶樣的活性，催化底物顯色造成假陽(yáng)性，嚴(yán)重溶血標(biāo)本禁用。
1.2采血試管洗滌不徹底、反復(fù)使用易交叉污染；塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會(huì)使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性。最好使用一次性玻璃試管或真空管采血管；并使用非抗凝標(biāo)本，肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值，可能與高濃度肝素具有強(qiáng)大的負(fù)電荷能吸附酶標(biāo)記物不易洗脫有關(guān)；EDTA鈉或鉀鹽、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過(guò)氧化物酶活性。
1.3標(biāo)本凝固不全 ，正常血液采集后1/2~2h開始凝固，18~24h完全血塊完全收縮。在工作中，有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間快速檢測(cè)，常在血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過(guò)程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊或附著在酶標(biāo)板孔壁內(nèi)使酶標(biāo)記物不易洗掉，易造成假陽(yáng)(陰)性結(jié)果；因此血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?br />
2、試劑的影響
2.1乙肝兩對(duì)半試劑廠家較多；不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，資料顯示[1]，不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為89.4%—99.3%,78~89%存在較大差異。有的廠家酶標(biāo)板孔間A值差大于15%；標(biāo)記酶的活性及顯色液的穩(wěn)定比較差。使用質(zhì)劣的試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽(yáng)性或假陰性。因此。選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之一。
2.2不同方法學(xué)的檢測(cè)試劑，會(huì)使兩對(duì)半結(jié)果出現(xiàn)一些不同。例如：在實(shí)際工作中常用ELISA檢測(cè)HBsAg結(jié)果為陰性，而電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)為陽(yáng)性。除方法學(xué)的靈敏度外；還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的差別。單抗對(duì)變異抗原或亞型乙肝標(biāo)志物檢測(cè)存在差異，建議試劑廠家對(duì)劑的制備應(yīng)該考慮亞型及型濃度的問(wèn)題。
3、操作技術(shù)的影響
3.1加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準(zhǔn)確性，直接影響檢測(cè)結(jié)果。由于吸嘴構(gòu)造特殊，導(dǎo)致清洗困難，加大了交叉污染的機(jī)會(huì)。建議用一次性吸嘴。加樣器也要經(jīng)常清洗，定期校準(zhǔn)。
3.2溫浴影響，96孔酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)特別；易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對(duì)溫度有嚴(yán)格要求，酶標(biāo)板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異；干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。
3.3冼滌是ELISA操作的重要環(huán)節(jié)，手冼條件一致性較差，對(duì)結(jié)果影響較大，半自動(dòng)與全自動(dòng)冼板機(jī)使用不當(dāng)也會(huì)影響結(jié)果，血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機(jī)針小孔全阻塞或半阻塞狀態(tài)，造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不徹底，導(dǎo)致“花板”造成假陽(yáng)性或假陰性；所以操作洗板機(jī)過(guò)程中要不時(shí)觀察洗板機(jī)針孔內(nèi)洗液的通暢狀況，及時(shí)糾正，洗板機(jī)不用時(shí)應(yīng)用去離子水清冼幾遍。
3.4肉眼判斷結(jié)果時(shí)，顯色淺不易觀察，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須使用酶標(biāo)儀檢測(cè)，以保結(jié)果一致性。
4、HooK效應(yīng)影響
隨著ELISA一步法的應(yīng)用，一些標(biāo)本中抗原含量過(guò)高，產(chǎn)生HooK效應(yīng)。影響檢測(cè)結(jié)果，采用同步稀釋測(cè)定或使用線性范圍高的兩對(duì)半定量法可以減HooK反應(yīng)的發(fā)生。
5、干擾物質(zhì)的影響
有人認(rèn)為大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測(cè)結(jié)果；常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。如RF因子可與標(biāo)記二抗的FC段法結(jié)合造成假陽(yáng)性，補(bǔ)體從C1q活化，使一抗和酶標(biāo)二抗的抗體分子發(fā)生變構(gòu)，F(xiàn)c的C1q分子結(jié)合點(diǎn)暴露出來(lái)，則補(bǔ)體C1q可將二者連接起來(lái)造成假陽(yáng)性，采用56℃30分鐘滅活補(bǔ)體可降低假陽(yáng)性率，高濃度的AFP（如孕婦），在儲(chǔ)存過(guò)程中可能形成二聚體會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深影響檢測(cè)結(jié)果。
6、藥物的影響
6.1、高效價(jià)的乙肝免疫球蛋白會(huì)與HBsAg形成復(fù)合物，影響HBsAg的檢出，所以一些HBsAg陽(yáng)性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg檢測(cè)會(huì)呈陰性反應(yīng)，導(dǎo)致乙肝兩對(duì)半少見模式的出現(xiàn)，如我們常遇到乙肝大三陽(yáng)的孕婦，為阻斷乙肝母嬰垂直傳播時(shí)，在孕第8、9、10月常規(guī)注射200mg乙肝免疫球蛋白，不僅影響孕婦HBsAg的檢出；而且其所生產(chǎn)的生新兒也常出現(xiàn)HBsAg陰性，HBeAg 陽(yáng)性和HBcAb陽(yáng)性等少見模式、可能是乙肝免疫球蛋白屬IgG抗體能通過(guò)胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)與胎兒血液中的HBsAg結(jié)合形成復(fù)合物；則新生兒HBsAg檢測(cè)呈陰性；用0.5M的鹽酸處理標(biāo)本1小時(shí)可提高出率[2]。
6.2、為預(yù)防乙肝，部分HBsAg陰性人群在接種乙肝疫苗后的1—2周內(nèi)，血清中可檢出HBsAg成份，形成一過(guò)性HBsAg陽(yáng)性，這可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能夠把它檢出；如電化學(xué)發(fā)光法，建議接種乙肝疫苗后1個(gè)月內(nèi)不應(yīng)作HBsAg檢測(cè)。
總之，乙肝兩對(duì)半檢測(cè)必須排除各種影響因素的干擾才能為臨床提供正確可靠的檢測(cè)結(jié)果。
參考文獻(xiàn)：
1、張彥等，廣東省常見乙肝檢測(cè)ELISA試劑的抽樣調(diào)查，數(shù)理醫(yī)學(xué)雜志，1996，9，（4），352-353
2、林晨等；酸解離HBsAg免疫復(fù)合物以提高HbsAg檢出率的探討，上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，1995，10，（3），167。
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