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1.如何選用培養(yǎng)基？
培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，首選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，各種目的無血清培養(yǎng)的首選是AIM V培養(yǎng)基（SFM）。在開始進(jìn)行新的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可以參考下表所列的條件：
細(xì)胞系 細(xì)胞類型 種 組織 推薦使用的培養(yǎng)基
293 成纖維細(xì)胞 人 胚胎腎 MEM, 10% 熱滅活馬血清
3T6 成纖維細(xì)胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
A549 上皮細(xì)胞 人 肺癌 F-12K, 10%胎牛血清
A431 上皮型 人 表皮細(xì)胞癌 DMEM, 10% 胎牛血清
A9 成纖維細(xì)胞 小鼠 結(jié)締組織 DMEM, 10%胎牛血清
AtT-20 上皮細(xì)胞 小鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和2.5% 胎牛血清
BALB/3T3 成纖維細(xì)胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
BHK-21 成纖維細(xì)胞 倉鼠 腎 GMEM, 10% 胎牛血清 或MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
BHL-100 上皮細(xì)胞 人 乳房 McCoy'5A, 10% 胎牛血清
BeWo 上皮滋養(yǎng)層 人 絨毛癌 F-12K, 15%胎牛血清
BT 成纖維細(xì)胞 牛 鼻甲骨細(xì)胞 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA
Caco-2 上皮細(xì)胞 人 結(jié)腸腺癌 MEM, 20% 胎牛血清 和NEAA
Chang 上皮細(xì)胞 人 肝臟 BME, 10% 小牛血清
CHO-K1 上皮細(xì)胞 倉鼠 卵巢 F-12, 10% 胎牛血清
Clone 9 上皮細(xì)胞 大鼠 肝臟 F-12K, 10% 胎牛血清
Clone M-3 上皮細(xì)胞 小鼠 黑素瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
COS-1 成纖維細(xì)胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-3 成纖維細(xì)胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-7 成纖維細(xì)胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
CRFK 上皮細(xì)胞 貓 腎 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
CV-1 成纖維細(xì)胞 猴 腎 MEM, 10% 胎牛血清
D-17 上皮細(xì)胞 狗 骨肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Daudi 成淋巴細(xì)胞 人 淋巴瘤病人血液 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
GH1 上皮細(xì)胞 大鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% , 胎牛血清
GH3 上皮細(xì)胞 大鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和2.5% 胎牛血清
H9 成淋巴細(xì)胞 人 T細(xì)胞淋巴瘤 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HaK 上皮細(xì)胞 倉鼠 腎 BME, 10% 小牛血清
HCT-15 上皮細(xì)胞 人 結(jié)腸直腸腺癌 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
HeLa 上皮細(xì)胞 人 子宮頸癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA (in suspension, S-MEM)
HEp-2 上皮細(xì)胞 人 喉 癌 MEM, 10% 胎牛血清
HL-60 成淋巴細(xì)胞 人 早幼粒細(xì)胞白血病 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HT-1080 上皮細(xì)胞 人 纖維肉瘤 MEM, 10% HI 胎牛血清 和NEAA
HT-29 上皮細(xì)胞 人 結(jié)腸腺癌 McCoy's 5A, 10% 胎牛血清
HUVEC 內(nèi)皮細(xì)胞 人 臍帶 F-12K, 10% 胎牛血清 和 肝素鹽 100 ug/ ml
I-10 上皮細(xì)胞 小鼠 睪丸癌 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
IM-9 成淋巴細(xì)胞 人 骨髓瘤病人骨髓 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
JEG-2 上皮細(xì)胞 人 絨毛膜癌 MEM, 10% 胎牛血清
Jensen 成纖維細(xì)胞 大鼠 肉瘤 McCoy's 5A, 5% 胎牛血清
Jurkat 成淋巴細(xì)胞 人 淋巴瘤 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
K-562 成淋巴細(xì)胞 人 骨髓性的白血病 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
KB 上皮細(xì)胞 人 口腔癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
KG-1 骨髓白細(xì)胞 人 紅白血病病人骨髓 IMDM, 20% 胎牛血清
L2 上皮細(xì)胞 大鼠 肺 F-12K, 10%胎牛血清
L6 大鼠 骨骼肌成肌細(xì)胞 DMEM, 10% 胎牛血清
LLC-WRC 256 上皮細(xì)胞 大鼠 癌 Medium 199, 5% 馬血清
McCoy 成纖維細(xì)胞 小鼠 未知 MEM, 10% 胎牛血清
MCF7 上皮細(xì)胞 人 乳腺癌 MEM, 10% 胎牛血清 NEAA, 10ug/ml 胰島素
WEHI-3b 類巨噬細(xì)胞 小鼠 骨髓單核細(xì)胞白血病 DMEM, 10% 胎牛血清
WI-38 上皮細(xì)胞 人 胚胎肺 BME, 10% 胎牛血清
WISH 上皮細(xì)胞 人 羊膜 BME, 10% 胎牛血清
WS1 人 胚胎皮膚 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
XC 上皮細(xì)胞 大鼠 肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Y-1 上皮細(xì)胞 小鼠 腎上腺瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
2.為什么要熱滅活血清？
加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。
3.L－谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？
L－谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L－谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L－谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定。L－谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。
4.GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？
GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，將其不穩(wěn)定的α－氨基用L－丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L－谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L－谷氨酰胺幾乎完全降解。
5.為什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
6.如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？
用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200－2000個(gè)/毫升，在0.1毫升的細(xì)胞中加入0.1毫升的0.4％的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞?；罴?xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。
7.如何消除組織培養(yǎng)的污染？
當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查HEPA過濾器。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。
1.在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。
2.分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3.每天觀測細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。
4.確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2－3代。
5.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。
6.重復(fù)步驟4。
7.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4－6代，確定污染是否以已被消除。
8.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？
丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源。盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。
9.為什么儲(chǔ)存在冰箱中的胎牛血清會(huì)出現(xiàn)沉淀？
GIBICO的胎牛血清 沒有預(yù)老化，儲(chǔ)存在2－8℃時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會(huì)影響血清的質(zhì)量。推薦在－20℃儲(chǔ)存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。
10.目錄上說，Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？
Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）和Earle’s平衡鹽溶液（EBS）有什么本質(zhì)的功能差別？
HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會(huì)變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hanks液就可以了。 11.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?
Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執(zhí)行的所有的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)程序，而且除了這些標(biāo)準(zhǔn)檢測，Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測：
End-Point Determination of Endotoxin Content
噬菌體檢驗(yàn)
生物化學(xué)檢測
激素的檢測
血紅蛋白檢測 |
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