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北京畢特博生物技術(shù)有限責(zé)任公司
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關(guān)鍵詞：電泳凝膠脈沖脈沖場(chǎng)凝膠電泳PFGE
【實(shí)驗(yàn)原理】
大分子DNA(一般長(zhǎng)度超過(guò)20kb，在某些情況下，超過(guò)40kb)在電場(chǎng)作用下通過(guò)孔徑小于分子大小的凝膠時(shí)，將會(huì)改變無(wú)規(guī)卷曲的構(gòu)象，沿電場(chǎng)方向伸直，與電場(chǎng)平行從而才能通過(guò)凝膠。此時(shí)，大分子通過(guò)凝膠的方式相同，遷移率無(wú)差別(也稱“極限遷移率”)，不能分離。脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)解決了這一難題，它應(yīng)用于分離純化大小在10～2000kb 之間的DNA 片段。
這種電泳是在兩個(gè)不同方向的電場(chǎng)周期性交替進(jìn)行的，DNA分子在交替變換方向的電場(chǎng)中作出反應(yīng)所需的時(shí)間顯著地依賴于分子大小，DNA 越大，這種構(gòu)象改變需要的時(shí)間越長(zhǎng)，重新定向的時(shí)間也越長(zhǎng)，于是在每個(gè)脈沖時(shí)間內(nèi)可用于新方向泳動(dòng)的時(shí)間越少，因而在凝膠中移動(dòng)越慢。反之，較小的DNA 移動(dòng)較快，于是不同大小的分子被成功分離。在許多實(shí)用的PFGE 方法中，倒轉(zhuǎn)電場(chǎng)凝膠電泳是最簡(jiǎn)單最常用的方法(FIGE)。通過(guò)把一個(gè)在不同電場(chǎng)方向有不同脈沖方式的脈沖電場(chǎng)加在樣品上，倒轉(zhuǎn)電場(chǎng)凝膠電泳(FIGE)設(shè)備能把大小范圍在10～2000kb 的DNA 片段分開(kāi)。FIGE也可通過(guò)重新確定一個(gè)對(duì)準(zhǔn)完全固定好角度的電場(chǎng)，這樣會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)展其分離極限達(dá)到10Mb。
【儀器、材料與試劑】
1. 制備DNA 樣品所需材料
1)TEN 緩沖液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA)。
2)Seaplaque 瓊脂糖(EC 緩沖液中濃度為2%)。
3)EC 緩沖液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%
Brij58；0.2% 脫氧膽酸鹽(Deoxycholate)；0.5%十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)。（生物秀實(shí)驗(yàn)頻道 www.bbioo.com）
4)ESP 緩沖液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸鈉，lmg/mL 蛋白酶K)。
5)溶葡萄球菌素(5mg/mL)。
6)RNase(10mg/mL)。
7) 膠模(由常規(guī)瓊脂糖凝膠制得或購(gòu)買成品)。
8)苯甲基橫酰氟(PMSF)(17.4mg/mL 于乙醇中)。
9)0.5μg/mL 溴化乙錠
2.分離、純化大的DNA 片段所需材料
1)紫外遞質(zhì)。
2)10mg/mL tRNA。
3)5mol/L NaCl。
4)苯酚/氯仿。
5)3mol/L NaAc，pH5.2。
6)95%乙醇。
易生物儀器庫(kù)：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物試劑庫(kù)：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
3.設(shè)備
1)TBE 緩沖液。
2)Seakem HGT 瓊脂糖。
3)Wide Mini-Sub Cell 凝膠電泳設(shè)備。
4)變速泵或蠕動(dòng)泵 (Bio-Red Laboratory)。
5)IBI FIJI 600 HV 程序性開(kāi)關(guān)設(shè)備。
6)緩沖液冷卻循環(huán)器 (Fotodyne ， New Britain ，WI) 或Mini Chiller(Bio-Rad Laboratory)。
【實(shí)驗(yàn)步驟】
1.脈沖電場(chǎng)凝膠電泳的DNA 樣品的制備
為避免大分子DNA 在提取過(guò)程中斷裂，細(xì)胞需在瓊脂糖凝膠塊中進(jìn)行原位裂解，在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用金黃色葡萄球菌(StapHylococcus
aureus)作為例子。
1)取100mL 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期金黃色葡萄球菌細(xì)胞于4℃，5000g 離心5min。
2)用20mL TEN 緩沖液沖洗沉淀，同樣條件離心5min。之后用10mL EC 緩沖液使細(xì)胞懸浮。
3)取1.5mL 細(xì)胞樣品與相同體積含2%SeaPLaque 瓊脂糖的EC
緩沖液迅速混合混勻并等分流溶液至封閉的模塊中于4℃凝固，混合前加熱至瓊脂糖熔解并冷卻至50℃。
4)對(duì)于每一個(gè)菌株，需要15～20 個(gè)凝膠塊，將它們放至含有30～45μg/mL RNase(50mL 的10mg/mL 的RNase)的10mL EC
緩沖液中，于37℃振搖過(guò)夜。
5)去掉裂解緩沖液，換為10mL ESP 緩沖液于50℃輕度振搖溫育48h。
6)將凝膠塊放在10mL 含有174μg/mL 苯甲基磺酰氟(PMSF)的TE 緩沖液中，室溫溫育4h(2h 換液一次)，以滅活ESP 中的蛋白酶K。
7)用TE 清洗瓊脂塊6h(2h 換液一次)，置于TE 中4℃保存。
2.限制酶消化
提高PFGE 的分辨率取決于100～1000kb 片段電泳結(jié)果的重復(fù)率，它與酶切關(guān)系密切，可在瓊脂糖凝膠塊中使用合適的內(nèi)切酶消化。（生物秀實(shí)驗(yàn)頻道
www.bbioo.com）
1)25μL10× 反應(yīng)緩沖液，30U 限制酶，加雙蒸水至250μL 混勻。
2)取一個(gè)凝膠塊置其中，合適溫度下溫育過(guò)夜(按內(nèi)切酶要求)后，用TE 緩沖液洗滌并貯存。
3.應(yīng)用PFGE 對(duì)樣品DNA 進(jìn)行分析
1)用0.5×TBE 緩沖液制備一個(gè)0.8%SeakemHGT 瓊脂糖凝膠，膠的厚度盡量與樣品凝膠塊相符。若用Wide Minisub Cell
進(jìn)行電泳的話，50mL 該溶液即可。
2)膠凝后，小心移去樣品梳。將凝膠塊用小刀切成與加樣孔一致的大小，將樣心地插入加樣孔，避免產(chǎn)生氣泡。(若樣品在溶液中，以l:1
的比率與 50℃2%Seaplaque 瓊脂糖相混合，迅速注入加樣孔中)。
3)把膠放入電泳槽內(nèi)，加緩沖液，剛好覆蓋膠的表面即可，緩沖液事先14℃冷卻。
4)將電泳槽和一個(gè)連著穩(wěn)壓電源的程序性開(kāi)關(guān)設(shè)備相連。打開(kāi)電源，調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵到適當(dāng)流速(5～10mL/rain)或打開(kāi)變速泵至40。
5) 通過(guò)計(jì)算機(jī)啟動(dòng)極性轉(zhuǎn)換程序。大于50kb 的限制性片段在1.2s 和0.4s 正向和反向的電脈沖下得以分離，時(shí)間一般為3.5h 或更長(zhǎng)。小于50kb
的限制性片段在0.4s正向和0.2s 反向的電脈沖(比率為2:1)下得以分離，時(shí)間為3～5h。
6)在 0.5μg/mL 溴化乙錠中進(jìn)行染色并拍照。
4.分離、純化大的DNA 片段
1)凝膠染色、分析后，在目的帶前(靠近正極處)切一個(gè) 0.25cm2左右的槽，注入0.8%Seaplaque瓊脂糖，使之凝固。
2)重新打開(kāi)極性轉(zhuǎn)換開(kāi)關(guān)，用紫外遞質(zhì)檢測(cè)DNA的遷移，當(dāng)目的帶進(jìn)入Seaplaque凝膠中時(shí)，關(guān)閉開(kāi)關(guān)，切下目的帶，移至1.5mL EP 管中。
3)加入2μL 的tRNA，30μL 5mol/L NaCl，370μL 蒸餾水，在65～70℃之間，化膠并保溫10min。
4)苯酚/氯仿500μL 抽提兩次。
5)用2.5 倍體積95%乙醇和1/10 體積NaAc(3mol/L，pH5.2)于-70℃10min 沉淀水相。再用70%乙醇洗兩次并將沉淀溶于TE
緩沖液中。
【注意事項(xiàng)】
1.換緩沖掖時(shí)盡可能小心不要碰壞瓊脂凝膠。
2.PMSF 是一個(gè)強(qiáng)烈的蛋白酶共價(jià)抑制劑，即有毒又揮發(fā)，操作時(shí)應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。
3.用蛋白酶K 包埋的材料時(shí)50℃溫育時(shí)間很長(zhǎng)(24～48h)，有些學(xué)者提出如此長(zhǎng)時(shí)間不必要(Mortimer et
al.1990)，且可能造成高分子質(zhì)量DNA 降解。在實(shí)驗(yàn)中可視情況而定。
4.瓊脂糖凝膠塊在TE(pH7.6)中4℃可存放數(shù)年，如在0.5mol/L EDTA 中可存放更長(zhǎng)時(shí)間。
5.一些高壓電源并不適合脈沖電場(chǎng)凝膠電泳，因?yàn)檫@些電源設(shè)計(jì)時(shí)均帶有保護(hù)電路，它可以檢測(cè)到負(fù)載的突然降低并且引發(fā)外加電源自動(dòng)關(guān)閉。
6.由于電壓較高，就會(huì)產(chǎn)生熱量，為了保證溫度為14℃，需要一些冷卻設(shè)備(緩沖液冷卻循環(huán)器或MiniChiller)。此外，把電泳系統(tǒng)放在一個(gè)敞口的冰盒中也可保持恒溫。
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