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| 購(gòu)買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 www.effectnews.cn |
1968年美國(guó)科學(xué)家Dr. Levin和Bang建立了鱟試驗(yàn)法。此后世界各國(guó)對(duì)鱟試劑的生產(chǎn)和應(yīng)用得以迅速發(fā)展。1980年美國(guó)藥典20版首先收載了細(xì)菌內(nèi)毒素檢 查法。隨后，英國(guó)藥典、日本藥局方、中國(guó)藥典等也相繼收載了該方法。本文主要對(duì)中國(guó)藥典1995年版與英國(guó)藥典1995年增補(bǔ)本、美國(guó)藥典23版和日本藥局方13版等的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行了比較。 1 檢驗(yàn)品種的比較 中國(guó)藥典1995年版二部共收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查品種12個(gè)，2000年版二部增至47個(gè)，而美國(guó)藥典23版收載了471個(gè)品種進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。因此，我們需加緊對(duì)更多的品種進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究，加快該法對(duì)藥品檢驗(yàn)的普及和推廣工作，提高我國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)水平。 2 檢驗(yàn)方法的比較 細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)的方法有凝膠法、濁度法、顯色基質(zhì)法、免疫學(xué)法等。其中凝膠法多為限量 檢查法，濁度法和顯色基質(zhì)法為定量檢查法，且后兩種方法都屬于分光光度法。濁度法還可 分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法；顯色基質(zhì)法也可分為終點(diǎn)顯色基質(zhì)法和動(dòng)態(tài)顯色基質(zhì)法。 凝膠法是較為經(jīng)典的方法，各國(guó)藥典都有收載，而收載了細(xì)菌內(nèi)毒素定量測(cè)定法的有美國(guó)藥典、英國(guó)藥典、歐洲藥典和日本藥局方等。中國(guó)藥典1995年版只收載了凝膠法，2000年版才涉及到定量測(cè)定法。因此，我們還需要對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素定量測(cè)定進(jìn)行研究，需要有供定量測(cè)定 用的標(biāo)準(zhǔn)品、儀器和試劑，以后逐步建立起我國(guó)的細(xì)菌內(nèi)毒素定量測(cè)定方法。 3 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品 各國(guó)藥典均設(shè)置了細(xì)菌內(nèi)毒素的標(biāo)準(zhǔn)品，其中中國(guó)藥典、英國(guó)藥典和美國(guó)藥典還可采用根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)定的工作標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ諛?biāo)準(zhǔn)品。除英國(guó)藥典采用U為內(nèi)毒素的單位外，其余各國(guó)藥典都用EU為內(nèi)毒素的單位。 美國(guó)藥典和中國(guó)藥典對(duì)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品每一步稀釋時(shí)的混勻時(shí)間作出了明確規(guī)定。除中國(guó)藥典外，其余各國(guó)藥典規(guī)定了內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)貯備液在冰箱里保存不得超過14d，且用前應(yīng)在旋渦混 合器上充分混合至少3min。 4 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指與使用批號(hào)鱟試劑在一定時(shí)間內(nèi)不產(chǎn)生凝集反應(yīng)的注射用水。在英國(guó)藥典中，不允許用家兔熱原試驗(yàn)的技術(shù)檢查細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水是否含內(nèi)毒素。 5 試驗(yàn)準(zhǔn)備 由于內(nèi)毒素能吸附在塑料或玻璃制的小管或吸管表面，塑料材料也可能釋放干擾物質(zhì)，因此英國(guó)藥典要求檢查所用的材料，并建議檢驗(yàn)者在更換新批號(hào)的材料時(shí)要重新檢查。 在英國(guó)藥典中沒具體指明除去外源性內(nèi)毒素的方法，而在中國(guó)藥典和日本藥局方中明確指出 所用容器或器皿要在250℃條件下干烤至少1h。美國(guó)藥典也采用高溫烘烤法除去外源性內(nèi)毒素。無(wú)論使用什么材料，什么方法，都應(yīng)確認(rèn)在試驗(yàn)中沒有可被檢測(cè)的外源性內(nèi)毒素和(或)干擾作用。 6 限量法的檢查 6.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核 鱟試劑靈敏度的復(fù)核主要是用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制備成4個(gè)連續(xù)的2倍稀釋的系列溶液，即2λ(λ為鱟試劑靈敏度)、λ、0.5λ和0.25λ，然后按細(xì)菌內(nèi)毒素檢 查法下操作，最后根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算出每一系列稀釋液出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的最低濃度對(duì)數(shù)平均值，該平均值的反對(duì)數(shù)即為鱟試劑的靈敏度測(cè)定值。 除日本藥局方外，英國(guó)藥典和美國(guó)藥典均要求在做鱟試劑靈敏度復(fù)核時(shí)要設(shè)置陰性對(duì)照。中國(guó)藥典1995年版的1998年增補(bǔ)本中也增加了這一要求。有了陰性對(duì)照，才能證實(shí)鱟試劑及細(xì) 菌內(nèi)毒素檢查用水中沒有可測(cè)出的內(nèi)毒素，使試驗(yàn)更具科學(xué)性和可靠性。 對(duì)4個(gè)連續(xù)的2倍稀釋的系列溶液的檢出結(jié)果，美國(guó)藥典未做說(shuō)明，中國(guó)藥典則要求最高濃度4管均為陽(yáng)性，最低濃度4管均為陰性，而英國(guó)藥典和日本藥局方只要求最低濃度的結(jié)果為陰性。 此外，中國(guó)藥典和美國(guó)藥典要求靈敏度測(cè)定值在0.5λ～2.0λ之間，且包括0.5λ和2.0λ，英國(guó)藥典和日本藥局方則未對(duì)是否包括0.5λ和2.0λ做出說(shuō)明。 6.2 供試品干擾試驗(yàn) 供試品干擾試驗(yàn)與鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)最大的不同點(diǎn)在于溶解內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的溶劑除了用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水外，還要用未檢出內(nèi)毒素的供試品溶液或不超過最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)的稀釋液，其余操作和結(jié)果計(jì)算則大體相同。僅有英國(guó)藥典未要求用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 與供試品一同對(duì)照，用上述供試品稀釋內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品即可。 在英國(guó)藥典中排除干擾的方法有稀釋、過濾、中和、透析，或加入幾種不吸附內(nèi)毒素，使用更靈敏的鱟試劑等，且要求在干擾排除后，要在供試品中加入內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品后重復(fù)干擾試驗(yàn)，以驗(yàn)證所選處理方法能有效排除干擾而不影響內(nèi)毒素的測(cè)定。而在其他幾部藥典中提到的方法較少一些。 6.3 檢查法 在做供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時(shí)，需設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和樣品陽(yáng)性對(duì)照。美國(guó)藥典、英國(guó)藥典和日本藥局方對(duì)樣品陽(yáng)性對(duì)照都有規(guī)定，中國(guó)藥典是在1995年版的1998年增補(bǔ)本中增加這一項(xiàng)目的。因樣品陽(yáng)性對(duì)照可證明在試驗(yàn)條件下被檢查的供試品溶液中不存在干擾作用 。 在英國(guó)藥典中還提出，如有必要，可使用0.1 mol/L的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液或一種合適 的緩沖液調(diào)節(jié)供試品pH值，使其pH值在6.5~7.5之間。美國(guó)藥典和日本藥局方也有類似的要求，中國(guó)藥典目前還沒嚴(yán)格要求混合物的pH值。由于混合物的pH值在6.5~7.5之間時(shí)，細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生最佳凝結(jié)，所以對(duì)混合物的pH值做出限定還是有必要的。 6.4 結(jié)果判斷 幾部藥典都要求當(dāng)設(shè)置的陽(yáng)性對(duì)照、供試品陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性，陰性對(duì)照為陰性，試驗(yàn)才有效 。供試品管均為陰性則認(rèn)為符合規(guī)定；若為陽(yáng)性則不符合規(guī)定；如一管為陰性，一管為陽(yáng)性則需復(fù)試。 7 定量法的檢查 美國(guó)藥典和英國(guó)藥典沒有制定出細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢查法的具體操作，但需要證明該法中的標(biāo) 準(zhǔn)曲線符合直線回歸要求，對(duì)終點(diǎn)法還要求其截距應(yīng)近似為零，然后通過內(nèi)推法確定被測(cè)物 質(zhì)的內(nèi)毒素含量。 在日本藥局方中收載了兩種細(xì)菌內(nèi)毒素定量測(cè)定法。第一種是凝膠法，該法要求用細(xì)菌內(nèi)毒 素檢查用水將供試品和內(nèi)毒素分別稀釋為4個(gè)濃度，供試品的稀釋倍數(shù)分別為1、2、4、8倍 ，內(nèi)毒素濃度則分別為2λ、λ、0.5λ和0.25λ，每個(gè)濃度均做2管，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，按檢查法操作。對(duì)于供試品稀釋液，先計(jì)算出溶液的終點(diǎn)濃度，以每一終點(diǎn)對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)(以十進(jìn)位小數(shù)表示)乘以λ，供試品溶液中內(nèi)毒素的濃度則通過計(jì)算供試品溶液稀釋后測(cè)得的終點(diǎn)濃度的幾何平均值獲得。 第二種光度法需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)和用供試品溶液進(jìn)行的抑制或增強(qiáng)試驗(yàn)。然后按檢查法做2管供試品管，同時(shí)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(即陽(yáng)性對(duì)照)，設(shè)置陰性對(duì)照和樣品陽(yáng)性對(duì)照。其中樣品陽(yáng)性對(duì)照的內(nèi)毒素濃度為標(biāo)準(zhǔn)曲線中的最高濃度和最低濃度的中間值。供試品內(nèi)毒素濃度可用陽(yáng)性對(duì)照組產(chǎn)生的回歸曲線計(jì)算。 在細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢查法中采用的鱟試劑，生物特異性好，標(biāo)準(zhǔn)化程度高，操作簡(jiǎn)單，成本低廉，使得這一方法越來(lái)越得到普遍的應(yīng)用。 通過對(duì)各國(guó)藥典中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的比較，可以看出中國(guó)藥典在此法上已做了很大的改進(jìn)，但還存在一定的差距。我們相信更規(guī)范、更科學(xué)、更先進(jìn)的中國(guó)藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法終將出臺(tái)，繼續(xù)指導(dǎo)我們對(duì)藥品的質(zhì)量監(jiān)督，發(fā)揮出更大的作用。
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