Tharmac® Cellspin 載玻片離心機簡介 （點擊標題進入詳細）
胚胎冷凍儀 （點擊進入）
我們實驗室飼養(yǎng)層細胞STO的傳代
1.當細胞鋪滿整個平皿(100mm)后,吸棄舊培養(yǎng)液，10mLPBS洗一遍
2.0.25%胰酶（預熱20分鐘左右）2ml消化，輕輕搖晃，直至肉眼見單層細胞呈塊狀脫落（或在顯微鏡下觀察細胞之間分離），立刻加5ml(DMEM+10%FBS)終止消化，輕柔吹打8-10次成單細胞。
3.離心1000rpm*5min,棄上清，加DMEM+10%FBS輕柔吹打。
4.將細胞懸液1:4傳到100mm細胞培養(yǎng)皿中，每個皿加10ml(DMEM+10%FBS)培養(yǎng)液，正常情況下2-3天就可以長滿，期間不用換液。
小鼠ES-R1細胞系傳代。
因為我們用飼養(yǎng)層細胞鋪皿而不是明膠包被，所以傳代之前必須處理飼養(yǎng)層細胞。
1.飼養(yǎng)層細胞STO處理：當STO鋪滿平皿后，向培養(yǎng)液中加入100ul 1mg/mlmitomycinC(toxic, 操作時不要接觸，作用是抑制STO增殖)，輕輕搖晃平皿，保證絲裂霉素分布均勻，放置于培養(yǎng)箱中處理2h后，吸棄培養(yǎng)液，10mlPBS洗兩遍（目的是把mitomycinC洗凈），0.25%胰酶消化，5ml(DMEM+10%FBS)終止，離心1000rpm*5min棄上清，加DMEM+10%FBS后吹打均勻，種到新的100mm細胞培養(yǎng)皿，補齊培養(yǎng)液至10ml。置于培養(yǎng)箱中過夜。
2.第二天早上傳干細胞：
（1）吸棄舊培養(yǎng)液，10mlPBS洗一遍，2ml 0.25%胰酶消化，邊消化邊輕輕晃動培養(yǎng)皿，4-5min后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)部分細胞脫落，成小的細胞團塊，加8ml DMEM+10%FBS終止消化，輕柔吹打。
（2）然后將液體轉移到15ml塑料離心管中，靜置10-15min，吸棄上清，加2mlES培養(yǎng)液。
（3）將滴管在酒精燈下拉成非常細的玻璃管，吹打1－2次，盡量將ES吹散
（4）將前一天鋪好的STO的培養(yǎng)液吸棄，換成10ml的ES培養(yǎng)液（操作要小心，不然STO很容易脫落），再把塑料離心管中的ES1:3或1:4(視情況而定)傳到鋪好的STO皿中，前后左右垂直晃動幾下，使干細胞分布均勻，置于培養(yǎng)箱中，每天換液，兩到三天傳代。
應該注意的問題：
1.STO不管是在ES傳代還是換液過程中都可能因為加液體速度過快而脫落，所以最好靠近培養(yǎng)皿壁先一滴一滴加，避免液體直接打在STO上。
2.玻璃管拉得盡量細一些。
3.一定要把mitomycin洗干凈
我養(yǎng)過很多細胞，腫瘤細胞和正常細胞都有，總的感覺是腫瘤細胞要比正常細胞好養(yǎng)。先介紹一下目前手頭正在養(yǎng)的兩株細胞。
SNU-398:人肝癌細胞，培養(yǎng)液是1640+10mmol/LHEPES+1mmol/L丙酮酸鈉+1.5g/L碳酸氫鈉+10％FBS
PLC/PRF/5：人肝癌細胞，培養(yǎng)液是EMEM+0.1mmol/L非必需氨基酸+1mmol/L丙酮酸鈉+1.5g/L碳酸氫鈉+10％FBS
消化液是0.25％胰酶+0.03％EDTA
兩株細胞都是貼壁細胞，SNU－398消化時需先加入1ml（25cm2）消化液，使消化液均勻覆蓋瓶底后倒掉，然后再加入1ml消化液，室溫放置3分鐘左右，加入培養(yǎng)液8ml中止消化，吹打使細胞分散（動作要輕，避免氣泡），再分別將細胞液各3ml加入另外兩個新瓶子，添加培養(yǎng)液至8ml/瓶，繼續(xù)培養(yǎng)
PLC/PRF/5消化時只需加入1ml（25cm2）消化液，使消化液均勻覆蓋瓶底后靜置5分鐘左右，輕拍培養(yǎng)瓶幾下，然后加入培養(yǎng)液，一般也是一傳三，操作同SNU-398。
小鼠單核巨噬細胞RAW264.7的消化及傳代，RAW264.7因是單核巨噬細胞其生物學特性就是貼壁特別牢。
我得操作如下：
實驗前將DPBS及DMEM加溫到37度
使用Flask75培養(yǎng)瓶：
1、細胞貼壁生長，長滿瓶底70％時，棄去培養(yǎng)液，加DPBS10ml漂洗 一至兩次；棄去
2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher輕輕刮即可，離心后去除DPBS.用DMEM培養(yǎng)液10ml復吹打混懸細胞
3.分入新的培養(yǎng)瓶；
4. 入37℃5％CO2孵箱，幾小時后即可再貼壁 。
細胞生長很好。
我來談談HepG2細胞株的傳代經(jīng)驗：
首先在倒置顯微鏡下觀察生長融合達80%，不需要長滿，就準備傳代。倒掉舊的培養(yǎng)基，再用已經(jīng)高壓滅菌過的PBS洗1－2次，我用的是25平方厘米的培養(yǎng)瓶，加入1毫升已經(jīng)配制好的0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA(0.25%胰蛋白酶是用D-Hanks配制后先用濾紙過濾，再用一次性過濾器過濾除菌，再分裝成1ml的小包裝，剛好每次用完一個，避免每次反復凍存，會使胰酶的活性下降），加入的量以剛好蓋滿瓶底為宜。放到倒置顯微鏡下觀察變化，一旦發(fā)現(xiàn)細胞開始變園收縮，大約1－3分鐘時間，必要時可以吹打幫助細胞分散，就立即加入培養(yǎng)基中和胰酶，如有EDTA最好要離心（800rpm,5min)，棄上清夜，再加入完全培養(yǎng)基吹勻，再分瓶，一般一瓶可以分2－3瓶。放入5%的CO2培養(yǎng)箱，37度培養(yǎng)24小時后觀察。
細胞：vero(非洲綠猴細胞)
PK-15[豬腎細胞（表示要到第15代細胞才會穩(wěn)定)]
類型：貼壁細胞
來源：購自武漢病毒所細胞保存中心
由四川農業(yè)大學動物生物技術中心繁殖保存
傳代步驟：
棄去舊的生長液-->用無鈣鎂水(CMF)沖洗貼壁細胞數(shù)次(視細胞瓶的大小,3--5次)-->剩少許CMF,滴入 ATV 2--3滴-->搖勻細胞瓶中的液體,使ATV均勻的分布到瓶里的沒個地方-->放入37度二氧化碳溫箱中3--5min消化-->棄去ATV,加入生長液,拍打吸吹下細胞-->鏡下觀察-->分瓶-->作好記號,放入37度二氧化碳溫箱生長
細胞特點:vero細胞生命力強,在很多其他細胞被污染的不能在繼續(xù)做的時候,它還能頑強的活下去,但是它有個特點就是對ATV很敏感,一般陪的較好的ATV一下去它能在較短的時間內消化下來,這是在消化時要注意的問題;PK-15相對就沒有那么好傳了,它和 VERO剛好相反,它的消化要很長的時間.我在作實驗時選擇的最多的是MDBK,因為它張的最快;其次選擇VERO因其生命力強;最后在選PK-15和IBRS、BHK21等這些細胞！??！
我養(yǎng)貼壁生長的細胞腫瘤細胞(A549,SKBR3,MCF7):
根據(jù)細胞生長狀況3天左右傳代一次。棄去培養(yǎng)液，并用不完全培養(yǎng)液洗一遍，再加入1~2ml 0.25% 胰酶和0.03% EDTA溶液，放到倒置顯微鏡下觀察變化，一旦發(fā)現(xiàn)細胞開始變圓收縮，（A549大概要2分鐘，MCF7大概十幾秒，SKBR3要5分鐘左右）就立即加入完全培養(yǎng)基終止消化，用滴管吹打培養(yǎng)瓶壁，至細胞全部從培養(yǎng)瓶脫落，離心（1200rpm,2min)，洗滌一次，棄上清液，再加入完全培養(yǎng)基吹勻，分至新的培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
注意：加了EDTA的消化液一定要離心洗滌，否則會影響細胞生長狀態(tài)
我養(yǎng)貼壁生長的細胞肺癌細胞(A549,PG)
傳代步驟？：
棄去培養(yǎng)液，并用PBS洗一遍，再加入1~2ml 0.25% 胰酶和0.03% EDTA溶液，均勻分布于瓶底，在倒置顯微鏡下觀察變化，一旦發(fā)現(xiàn)細胞開始變圓收縮，（A549大概要2分鐘，PG要3分鐘左右）,倒掉消化液，立即加入完全培養(yǎng)基終止消化，吹打培養(yǎng)瓶壁，至細胞全部從培養(yǎng)瓶脫落，洗滌一次，棄上清液，再加入完全培養(yǎng)基吹勻，分至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。兩種細胞均容易成團生長，在傳代時要反復吹打。
我培養(yǎng)過VEC，KB-A-1/3等，現(xiàn)在養(yǎng)3T3-L1，講一些“消化”經(jīng)驗值吧，總覺得養(yǎng)細胞除非特殊，否則都差不多的手法的，當然這里我不提不同培養(yǎng)基了。
我的通常做法：細胞棄去上清培養(yǎng)基，PBS洗3次，0.125%胰蛋白酶加1ml，平晃培養(yǎng)瓶潤濕后立即倒去胰酶，接著就根據(jù)細胞不同性質等待消化的時間不同了，難消化的細胞（如KB）可以37度培養(yǎng)箱溫育片刻，一般2-3min都可以了，然后用含血清的培養(yǎng)基終止消化稀釋傳代就行了。
關鍵是潤濕后馬上棄去胰酶，這樣可以保證消化質量，也可以很大程度上避免消化脫落的細胞過后倒去胰酶是損失了。
神經(jīng)細胞原代培養(yǎng)
(Primary dissociated cell culture)
從動物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生動物的腦組織取下某一局部區(qū)域，分離細胞，培養(yǎng)在培養(yǎng)容器后不再移植，常稱為原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)。
一、培養(yǎng)前準備
1. 器械和器皿
器械：外科剪、鑷子、虹膜剪等、小剪刀、細鑷子和虹膜小刀等
各種金屬器械如解剖器械，使用后及時刷洗干凈，用酒精棉球擦拭后晾干，或經(jīng)60°C烘干，以防生銹。由于濕熱消毒對手術器械容易可用70－80％酒精浸泡1小時以上消毒。
器皿：1) 玻璃瓶及相應的膠塞或膠木螺旋蓋
用于分裝血清、多聚賴氨酸、解剖液、各種鹽溶液和培養(yǎng)液等。
2) 培養(yǎng)瓶、蓋玻片
培養(yǎng)用的蓋玻片必須不含鉛、不發(fā)霉，可用0.2N鹽酸浸泡10分鐘，用蒸餾水洗2次，每次10分鐘，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分鐘，再用雙蒸水洗2次，每次10分鐘，烘干待消毒。凡組織學用過的舊蓋玻片一般不用。
3) 移液管、吸管、燒杯、離心管和培養(yǎng)皿。
4) 塑料培養(yǎng)皿（35mm）、塑料培養(yǎng)板（6、24、96孔）。
輔助工具：放置試管、吸管和玻璃瓶等的架子。
2. 培養(yǎng)基和培養(yǎng)用液的配制
1) 培養(yǎng)基質：有多聚賴氨酸、牛皮膠原和鼠尾膠原。本室目前常用分子量為7-140，000多聚賴氨酸（Poly-L-lysine，濃度為0.1mg/ml。
2) 平衡鹽溶液：主要以無機鹽和葡萄糖配制而成。各種平衡鹽溶液主要的不同點在于NaCl的濃度、離子濃度及緩沖系統(tǒng)的不同，可根據(jù)實際需要選用適當?shù)钠胶恹}溶液。
3) 培養(yǎng)液：目前已有現(xiàn)成的干粉出售，按說明書進行配制即可。神經(jīng)細胞培養(yǎng)需高糖，培養(yǎng)液應含有或加葡萄糖至6g/L。目前培養(yǎng)海馬神經(jīng)元可選用B27無血清培養(yǎng)液。
4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和馬血清等。分裝成小瓶，4°C保存?zhèn)溆茫ǚ盅b前需56°C滅活30分鐘）。
5) 胰蛋白酶溶液：用于分離細胞。先用少量滅菌三蒸水將胰蛋白酶粉末溶成糊狀，然后補水至2.5%濃度，振蕩搖勻，4°C過夜，待完全溶解后用濾器過濾滅菌，并分裝成1~2ml凍存。用前以D-Hanks平衡鹽水或其他無鈣鎂離子溶液溶解稀釋至0.25%或0.125%。實際使用溫度一般為37°C 20~30分鐘。
6) 解剖溶液：由平衡鹽水（D1-無鈣鎂離子的Puck氏液）、HEPES緩沖液和蔗糖－葡萄糖溶液組成稱為D1-SGH。
D1平衡鹽水：NaCl 8.0g、KCl 0.4g、Na2HPO4.7H2O 0.045g、KH2PO4 0.03g、酚紅0.0012g、三蒸水50ml。
蔗糖－葡萄糖（SG）：蔗糖7.5g、葡萄糖3g、三蒸水50ml。
HEPES（H，0.352mM）：用25ml左右的三蒸水溶解2.35g的HEPES后，用NaOH或HCl調pH至7.3~7.4，加三蒸水至28ml。
將D1、SG和H三者合在 一起并稀釋到1000ml即為解剖液，小瓶分裝成5ml置4°C 備用。
二、培養(yǎng)細胞操作
1. 涂培養(yǎng)基
一般在細胞培養(yǎng)前1~2天，將使用的塑料培養(yǎng)皿（35mm）、24孔、96孔培養(yǎng)板或消毒的蓋玻片涂上一層Poly-L-Llisine，置于超凈臺中備用。
2. 實驗動物準備
動物的年齡和取材部位對培養(yǎng)細胞的成活率關系密切，需根據(jù)具體實驗而定。如大鼠海馬細胞培養(yǎng)，以18天胚胎或新生48小時內的大鼠為宜，而培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)與脊髓神經(jīng)元以11~13天胚胎小鼠、大腦皮層以小鼠16~21天、小腦細胞取自臨產或新生動物。
3. 進入培養(yǎng)室操作
1) 穿上消毒衣，戴上口罩和帽子。
2) 安放消毒的實驗用具，如培養(yǎng)皿、解剖器械、玻璃吸管、培養(yǎng)板等于桌面適當?shù)奈恢谩?br />
3) 將平衡鹽水、解剖溶液、血清、胰蛋白酶等溶液放置于桌面上，同時準備一個冰袋和污物盤。
4) 解剖動物以新生大鼠取海馬組織為例：將新生大鼠投入80％的酒精中，消毒5~10分鐘。用解剖剪斷頭，并移入玻璃器皿中，沿中間骨縫將頭骨剪開（頭骨外側下沿也剪開），然后剝開頭骨暴露大腦半球，去腦膜，沿中線將大腦半球往外翻開，暴露內側面半月狀的海馬組織。用彎頭鑷子輕輕夾起，放入解剖液內（培養(yǎng)皿可置于冰袋上）。待數(shù)個動物均解剖后，將培養(yǎng)皿內的海馬組織移至解剖鏡下，仔細去除血管、膜及非海馬結構（取材干凈非常重要）后，再移至小培養(yǎng)皿中，加數(shù)滴D1-SGH液，并用虹膜剪剪碎或用虹膜刀切成小粒。
5) 在上述海馬組織加入解剖溶液和0.25%胰蛋白酶各1ml，搖勻后置于37°C培養(yǎng)箱內消化25~30分鐘。
6) 將消化好的細胞碎片移入2ml的離心管中，吸去剩余的胰蛋白酶溶液，加入含血清的全培養(yǎng)液2ml終止胰酶作用，約10分鐘后，再更換一次全培養(yǎng)液以洗凈胰酶。（全培養(yǎng)液成份為80％DMEM、10％胎牛血清、10％馬血清或小牛血清，胎牛血清有助于細胞貼壁）。
7) 用口徑較小的、在火焰上光滑過的玻璃吸管吸取細胞團，移入另一離心管，加入2ml培養(yǎng)液并吹打20次。將離心管斜放，讓細胞碎片下沉5~10分鐘后，吸取上層細胞溶液約1ml。離心管中再加入培養(yǎng)液1ml，同上吹打并吸取細胞，與第1次吸取的細胞混合一起后計數(shù)。
8) 按所需的細胞濃度接種在事先準備的塑料培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)板中，用蓋玻片則需滴滿。接種后移入37°C的5％CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1天后可用無血清培養(yǎng)液，1星期換液2次。
三、細胞識別
根據(jù)細胞外形及內部結構進行細胞的識別。神經(jīng)細胞具有顯著的特征，培養(yǎng)中的貼壁的神經(jīng)元突起很明顯，特別是樹突由粗而細，有分支，突起的末端有膨大的生長錐結構，正在不斷變化；細胞體呈圓形、梭形、三角形或多角形不等，胞體較厚，具有空泡狀核，有明顯的核仁；立體感強，常見“暈”。
培養(yǎng)細胞中可包括幾種神經(jīng)元的類型和非神經(jīng)元的“背景細胞”，即成纖維細胞、室管膜細胞和幾種膠質細胞。
成纖維細胞貼壁最快，呈扁平狀，胞核卵園形，有并列的兩粒小核仁，從胞體兩端發(fā)出細長突起。膠質細胞貼附在膠原上和成纖維細胞形成一層“地毯”。神經(jīng)細胞貼壁較慢，落在“地毯”上生長遷移和分化。
培養(yǎng)的神經(jīng)細胞可按一般Nissl法染色或免疫細胞化學特異性染色加以鑒別。
細胞凍存與復蘇
細胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是無限的。細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。
細胞的凍存
【用品】
（1） 5%胰蛋白酶
（2） 含10%~20%血清培養(yǎng)液
（3） DMSO（分析純）或無色新鮮甘油（15磅蒸汽高壓消毒）
（4） 吸管、離心管、凍存管
【步驟】
（1） 從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存，但最好為對數(shù)生長期細胞，已經(jīng)長滿的細胞凍存后生存率低。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。
（2） 用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則不需處理。依據(jù)傳代方法把消化好的細胞收集于離心管并計數(shù)，離心。
（3） 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入配制好的凍存培養(yǎng)液（含10%DMSO或甘油），凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml~1×107/ml。用吸管輕輕吹打使細胞均勻，然后分裝入無菌凍存管中。
（4） 裝完細胞后的凍存管即可直接凍存。以本教研室對L929的凍存程序作為大家進行細胞凍存的參考：將凍存管放入4℃冰箱 2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面過夜。以后取出凍存管移入液氮容器內。在放入液氮時，要帶手套操作以免凍傷。
細胞在液氮中儲存時間理論上是無限的，但為妥善起見，特別是很多為被凍存過的細胞在首次凍存后要在短期內復蘇一次觀察細胞對凍存的適應性。已建系的細胞最好也每年取一支復蘇一次后，再繼續(xù)凍存。
細胞的復蘇
【用品】培養(yǎng)液，吸管，離心管，培養(yǎng)瓶，37℃溫水
【步驟】
（1） 從保存凍存管的支架中取出凍存管應直接投入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。如果凍存管密封不嚴，在保存過程中液氮進入凍存管中，從液氮罐中取出時由于溫度升高導致液氮急速氣化而爆炸，可能會危及面部等。因此，存取凍存管時都要佩戴眼鏡和手套。
（2） 從37℃水浴中取出凍存管，用酒精消毒后，擰開凍存管，用吸管吸出細胞懸液，注入離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混合后低速離心，除去上清液，在重復用培養(yǎng)液洗一次。
（3） 用培養(yǎng)液適當稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放在37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。如果復蘇時細胞密度較高要及時傳代。
細胞復蘇時細胞數(shù)可以做10~20倍稀釋，接種密度以5×105/ml為宜。
細胞株的傳代與培養(yǎng)
培養(yǎng)細胞傳代根據(jù)不同細胞采取不同的方法。貼壁生長細胞如COS-7、CHO等用消化法傳代；部分貼壁生長的細胞如PC12用直接吹打即可傳代。下面主要介紹貼壁細胞的傳代。
一、用品
(1) 0.25％胰蛋白酶，全培養(yǎng)液
(2) 滴管，離心管，培養(yǎng)瓶(皿)，培養(yǎng)瓶蓋，注射器，計數(shù)6
皮乳頭
二、步驟
(1) 貼壁細胞的消化法傳代：
① 吸除瓶內舊培養(yǎng)液。
② 以50ml培養(yǎng)瓶為例，向瓶內加入2-3ml胰蛋白酶，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細胞表面。
③ 消化最好在37C或室溫25C以上環(huán)境下進行。消化后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進行觀察．發(fā)現(xiàn)胞質回縮、細胞間隙增大后。應立即終止消比，然后吸掉消化液后再加全培養(yǎng)液終止消化。
④ 用彎頭吸管，吸取瓶內培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，吹打過程要順序進行，從培養(yǎng)瓶底的一端開始到另一端結束，以保證所有的底部都被吹到。吹打動作要輕柔同時盡可能不要出現(xiàn)泡沫。這些都對細胞有損傷。細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液。
⑤ 計數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶內。
部分貼壁生長細胞，不經(jīng)消化處理直接吹打也可使細胞從瓶壁脫落下來，而進行傳代。但這種方法僅限于部分貼壁不牢的細胞，如Hela、PC12細胞等。直接吹打對細胞損傷較大，細胞常也有較大數(shù)目的丟失，因而絕大部分貼壁生長的細胞均需消化后，才能吹打傳代。
我養(yǎng)卵巢癌細胞SKOV3,貼壁生長，傳代步驟：
1.倒掉舊培養(yǎng)液，盡量倒凈。
2.如果是50ml的培養(yǎng)瓶，加入約1ml0.25％胰酶中和殘留培養(yǎng)液，倒出。也可用D-HANKS液洗一次，可以節(jié)約胰酶。
3.再加1ml0.25％胰酶消化，本人體會，新開瓶（指分裝的小瓶）使用的胰酶消化能力強，可以減少用量至0.5－0.8ml,已用較久的胰酶如用少了就不管用。
4.鏡下觀察，如果80％以上細胞都回縮變圓，立刻將培養(yǎng)瓶豎起，防止過度消化。
5.倒掉胰酶，用含10％小牛血清1640培養(yǎng)液5ml加入瓶內，按順序輕吹打，如瓶底由模糊變透亮，說明細胞已從瓶壁吹離。
6.此種細胞生長較快，所以一般按1傳5－6傳代，按瓶數(shù)補足培養(yǎng)液，吹勻后分別接種到新瓶中。
7.根據(jù)培養(yǎng)液顏色變化所提示的酸堿度變化，一般2天左右換液一次。
請不要重復發(fā)帖，謝謝配合、支持！ by victoh
liguofan wrote:
養(yǎng)平滑肌細胞，當細胞鋪滿瓶底，就可以傳代了。一般6天左右傳一代。先倒掉舊培養(yǎng)液，用pbs2ml洗兩遍，再加入0.05%的胰酶+0.02edta，加入的量以能覆蓋瓶底為準。加入后輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使液體覆蓋瓶底，然后在顯微鏡下觀察，當細胞之間出現(xiàn)間隙且有大部分細胞呈現(xiàn)圓形后即可。倒掉，加入含低濃度血清培養(yǎng)液，然后吹打瓶底各處使細胞脫落。離心后去除上清液，加全培，再分2瓶，補加培養(yǎng)液。
特點是胰酶濃度低，不預溫，消化后離心，不用pbs洗{細胞會失掉}
呵呵，看了這份帖子，我有點跟他不同的地方...也是平滑肌細胞，細胞融合后傳代，原代要在5－7天融合，傳第一代，之后一般4、5天傳一代。棄去培養(yǎng)液，加1ml胰酶0.25％（用前37度預熱），1min后棄去，重新加1ml胰酶，顯微鏡下觀察，大部分細胞變圓但沒有飄起來的時候加含血清的培養(yǎng)液終止消化，一般是3min，棄去胰酶，加2ml培養(yǎng)液；或不棄去胰酶，加3ml培養(yǎng)液，吹打細胞脫落并成單細胞懸液，將懸液直接移入新的培養(yǎng)瓶，原來的培養(yǎng)瓶再加3ml培養(yǎng)液，一起放入孵箱培養(yǎng)。
俺養(yǎng)時間最長的就是人外周血單個核細胞－－pbmc ，所以俺才會叫pbmc這個
網(wǎng)名，嘿嘿，扯遠了
pbmc是混雜的細胞群體，我的目的細胞是T 細胞，實驗記錄如下
一，目的：pbmc的分離和培養(yǎng)
二，所有的試劑; 淋巴細胞分離液（TBD公司) ，小妞血清（四季青），RPMI
－1640 （GIBICO)，rIL-2(長春什么公司），二巰基乙醇（sigma），慶大霉
素（哪里產的都行),HEPES(忘記產地了），L-Glutamin（生工），丙酮酸鈉（
生工），NaHCO3， HCL
三，實驗步驟
1，培養(yǎng)液的配制：
RPMI-1640干粉
二巰基乙醇 3.7 微升
丙酮酸鈉 110 毫克
HEPS 1 克
L－glutamin 200 毫克
慶大霉素 5萬 單位
NAHCO3 1 克
加3蒸水到1000ml,磁力攪拌器攪拌~~~~~~~~~ 調整ph植
2，淋巴細胞的常規(guī)分離（注意收集人血清備用！）
3，分離的pbmc的培養(yǎng)：按照1－2 x 10 6次方的濃度，放入24孔板內，每
孔加入細胞懸液1ml，加人血清200－300ul，rIL-2 50單位/孔，各種刺激劑按照
文獻加入（抗CD3,抗CD4 ，PHA等等），第3天分孔并加入rIL-2 ，50單位/孔。
最近半年一直在養(yǎng)293T細胞，其實我養(yǎng)的293T是經(jīng)過改良的，是斯坦福大學
nolan實驗室的phenix 系列中的一種（大家自己去找找看吧，就在學校主頁里面
有）
我養(yǎng)這細胞之前，也養(yǎng)過一批293T ,是從南京醫(yī)科大學搞到的，可惜，由于沒
有經(jīng)驗，被我養(yǎng)的半死不活，最終徹底完完了。
細胞拿來時候，我按照從網(wǎng)上和上找到的資料，用單獨的EDTA消化，
結果細胞長的非常難看，好多細小的顆粒在細胞的表面，然后細胞貼壁的情
況就不是很好，然后細胞就逐漸死掉了。后來我用直接吹打的方法，結果傳
代，動存，復蘇，都沒有問題，而且細胞狀態(tài)非常的好。我用的是DMEM＋10
％NCS（胎牛買不起?。?。凍存液配方是 4：5：1 ＝DMEM：小牛血清：DMSO
1 棄去舊培養(yǎng)液，用D-Hanks液沖洗細胞兩遍
2 加入0.25%胰酶與0.02%EDTA各10滴，置顯微鏡下觀察，三分鐘后倒去消化液，再用D-Hanks液沖洗細胞兩遍。
3 加入0.25%胰酶10滴，再消化三分鐘，加血清終止消化，吹打細胞（液體不夠可適當加入D-Hanks液）
4 離心8分鐘（1000轉/分鐘），去上清。加入D-Hanks液吹打混勻，再離心一遍。
5 加入培養(yǎng)基5毫升混勻細胞，按1：2分裝傳代！
忘記說了，我的是角質形成細胞的傳代
不同細胞傳代方法：
1.懸浮細胞：如k562，勿需消化離心，可直接由孵箱內取出---直立靜置1-3分鐘---吸取上層培養(yǎng)基1/3-2/3 --- 加入新配制的培養(yǎng)基（含雙抗和10%小牛血清）--- 傳代即可。
2.半貼壁細胞：如小鼠Lewis肺癌細胞，勿需消化離心，先傾出瓶內培養(yǎng)基---加入少量新配制的培養(yǎng)基（不含小牛血清）輕輕吹打均勻--- 加入新配制的培養(yǎng)基（應將吹打前加入的培養(yǎng)基體積考慮在內，使小牛血清濃度為10%，含雙抗）--- 傳代即可。
3.貼壁細胞：如L929，先消化離心---棄上清---加入少量新配制的培養(yǎng)基（不含小牛血清）輕輕吹打均勻--- 加入新配制的培養(yǎng)基（應將吹打前加入的培養(yǎng)基體積考慮在內，使小牛血清濃度為10%，含雙抗）--- 傳代即可。
注：操作過程應嚴格無菌，OK
本人培養(yǎng)的是DG-75細胞（B淋巴瘤細胞株），為懸浮細胞，使用1640加10％新生牛血清，未加雙抗，當培養(yǎng)液轉微黃時候，肉眼可見瓶內有細小顆粒，但整體清澈，倒置顯微鏡下可見細胞成葡萄狀成串，有立體感，即液體各個層面都有大量細胞團，是傳代的好時機。只需要吸取原培養(yǎng)液分裝到3-4個新的培養(yǎng)瓶，原瓶稍有液體覆蓋即可，各瓶再加培養(yǎng)液到8ml即可。
采用常規(guī)方法培養(yǎng)。人臍靜脈內皮細胞株ECV304（購自上海細胞生物學研究所）在含體積分數(shù)為10%胎牛血清（FPS）的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、體積分數(shù)為5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，3-4d換液傳代一次。實驗時采用對數(shù)生長期細胞。傳代時先倒掉舊培養(yǎng)液，用pbs５ml洗兩遍，再加入0.25%的胰酶+0.01%edta，加入的量以能覆蓋瓶底為準。加入后輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使液體覆蓋瓶底，然后大約半分鐘左右看一次，對著光源觀察瓶底細胞黏附面是否有裂縫（如有則在顯微鏡下可見細胞之間出現(xiàn)間隙且有大部分細胞呈現(xiàn)圓形），倒掉，加入含低濃度血清培養(yǎng)液，然后吹打瓶底各處使細胞脫落。離心后去除上清液，加全培，再分４瓶，補加培養(yǎng)液。這樣操作步驟可大大簡化，不需要將培養(yǎng)瓶拿出拿進操作臺了．
附:消化緩沖液(0.25%)胰蛋白酶： 胰蛋白酶干粉1.25g，0.1gEDTA，溶于50ml 10×D-Hanks溶液中，調節(jié)至PH 7.6，定容至500ml，22um濾膜過濾除菌，分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
請傳授養(yǎng)氣道平滑肌細胞的經(jīng)驗，第四代時大概可培養(yǎng)出多少細胞來
我也來談談我養(yǎng)過的細胞經(jīng)驗:
我養(yǎng)細胞肝癌細胞(H22),是采用體內傳代法
把肝癌細胞(H22)株濃度調整為2*10 6次方,腹腔內接種0.08ml,一般一周內即可
見到腹水生成,隨時間推移腹水逐漸增多.
這種方法養(yǎng)細胞保持細胞的各種特性,使用方便.
我養(yǎng)的也是vero（非洲綠猴腎cell):貼壁細胞。
傳代步驟比較傳統(tǒng)：倒掉培養(yǎng)液－>PBS洗2遍－>胰酶0.25%消化－>倒掉胰酶－>加培養(yǎng)基－>用吸管吹打均勻－>分瓶－>放置37度，5%CO2孵箱。
我的體會是（可能有不少不規(guī)范的地方，大家討論，指正）：
1.消化時間和實驗環(huán)境溫度也有很大關系，我們實驗室條件比較差，不能維持恒溫（不過我想大部分實驗室目前也還是做不到的）。夏天的時候，消化特別快。但是到了冬天，就很慢，要用手捂老半天。
3.消化到什么程度可以，經(jīng)驗很重要，如果每瓶消化都要通過顯微鏡觀察來判斷，首先效率太低，而且還很容易消化過頭。對光觀察培養(yǎng)瓶，當感覺到有些泛白，瓶角有少許細胞脫離的時候就可以了，倒掉消化液，用手輕拍培養(yǎng)瓶就能脫離了。
2.我們一般培養(yǎng)的時候，就用5%的小牛血清，只有剛傳代的時候才用10％的。感覺這樣，細胞不會長的特別快，3-4天換一次液完全沒有問題。
123
？！ by victoh
我說一下我養(yǎng)的人前列腺癌細胞株LNCaP：貼壁細胞
傳代過程：（以25ml培養(yǎng)瓶為例）
1. 移除舊培養(yǎng)液；
2. 加入1ml PBS或胰酶（0.25%Trypsin+0.02%edta)洗；
3. 加入1ml胰酶消化；
4. 鏡下觀察消化完全后，加入2-3ml培養(yǎng)液，反復輕輕吹打使細胞脫落并分散成單個細胞；
5. 轉移到10ml離心管，800轉4度下離心4分鐘，吸去上層液，加入少量培養(yǎng)液，輕輕吹打使均勻；
6. 吸取1ml于新培養(yǎng)瓶中，加入9ml培養(yǎng)液于37度，5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。
注意事項：
1. 培養(yǎng)液為10%胎牛血清（外國產）的RPMI1640，加雙抗（最終100單位）。根據(jù)我的經(jīng)驗：胎牛血清濃度越高，細胞貼壁越牢；
2. LNCaP雖然是貼壁細胞，但貼壁不牢，而細胞間作用較強，不易分散。因此操作過程中，加PBS和胰酶動作一定要輕要慢，否則細胞易成片脫落；
3. 消化時加入胰酶后，避免晃動培養(yǎng)瓶，否則細胞易成片脫落，導致不易消化成單個細胞。盡可能消化完全（鏡下觀察細胞成單個圓形，也可置于37度培養(yǎng)箱中消化），這樣才易吹打成單個細胞；
4. 不要等細胞長滿再傳代，傳代比例一般一傳三或一傳四，傳代周期一般為一周；
5. 不要用舊瓶舊皿傳代，否則細胞不貼壁；
6. 傳代后48小時內不要動，否則細胞不易貼壁；
7. 如果只要換液，新培養(yǎng)液最好在37度溫浴，因為加冷培養(yǎng)液易使細胞懸浮起來。
我們實驗需要養(yǎng)的是HELF(人胚肺成纖維細胞),這也是一種貼壁生長的細胞,所以傳代培養(yǎng)時的大概方法沒有什么不同.但這種細胞貼壁貼得不是很緊,所以消化過程中有幾點注意事項(本人總結):
1.當?shù)钩鲈信囵B(yǎng)液時,最好將培養(yǎng)瓶反過來,即有細胞的面朝上.
2.如用EDTA消化,最好先讓其消化3分鐘,后每一兩分鐘看一次.
3.每次看時不要太過晃動瓶子,以防細胞成片脫落.如果細胞成片脫落了就比較麻煩了,因為細胞已經(jīng)脫落,就不得不終止消化,但實際上細胞與細胞間的連接并沒有完全斷開,吹打也分不開,那樣分出來的細胞也就成團,則不利于細胞貼壁及生長.
4.如果在終止消化前有細胞脫落,不要浪費,先加Hank's液終止消化,然后離心,收集細胞,再讓其生長.
5.細胞生長狀態(tài)好時,一般5-7天可以長滿,其間換一次液就可以了.
6.但我也遇到過生長不太好的情況,細胞長了12天才長滿,且其中有幾天幾乎沒長或出現(xiàn)大量黑色死細胞團,這時不要放棄,只要活細胞不是太少,沒有關系.之所以長的慢或有死細胞,大概是消化時EDTA的損傷造成的,細胞恢復活性需要一定時間,且一旦活性恢復,細胞將長得很快.
以上是本人實驗中的一點小經(jīng)驗,希望有所幫助.
【專題討論】
我仔細翻看了一哈，好像說人肝癌BEL-7402細胞的比較少，我做的就是這種細胞，下面談談我的傳代步驟：
1. 棄去舊培養(yǎng)液（可用巴氏吸管吸去，也可直接翻轉培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)面朝上，直接倒掉培養(yǎng)液）。
2.PBS沖輕緩漂洗細胞兩遍，盡量洗去殘余血清，棄PBS液。
3 加0.25%胰酶（以蓋滿瓶底為標準）于37度條件下消化，倒置相差顯微鏡下觀察，細胞解離程度以細胞突起回縮，細胞間隙增大，細胞近乎縮成圓形為準。
4.直接加含血清的1640培養(yǎng)基（或血清)終止消化。
5.用彎頭吸管均勻有序的吹打細胞，動作不宜過猛，防止起泡產生。
5. 離心5分鐘（1000轉/分鐘），去上清。加入PBS液吹打混勻，再離心一遍。
6. 用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)液重懸細胞，按1：3傳代！
7.補加培養(yǎng)液至所用培養(yǎng)瓶容積的1/10為準。
8.送孵箱培養(yǎng)。
【專題討論】
我還做過骨髓間充質干細胞（MSC）的原代及傳代培養(yǎng)，下面談談我的傳代步驟：
1. 棄去舊培養(yǎng)液。
2.D-Hank's液輕緩漂洗細胞兩遍，盡量洗去殘余血清，棄去D-Hank's液。
3 加0.25%胰酶（以蓋滿瓶底為標準）于37度條件下消化，倒置相差顯微鏡下觀察，以細胞突起回縮，細胞間隙增大，細胞近乎縮成圓形為準。
4.直接加含血清的LG-DMEM培養(yǎng)基（或血清)終止消化。
5.用彎頭吸管均勻有序的吹打細胞，動作不宜過猛，防止起泡產生。
5. 離心5分鐘（1000轉/分鐘），去上清。
6.加入D-Hank's液吹打混勻，再離心一遍。
7. 用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，按1：2傳代。
8.補加培養(yǎng)液至所用瓶容積的1/10為準。
9.送孵箱培養(yǎng)。
我也來說說腫瘤細胞鼠黑色素瘤B16細胞的培養(yǎng)，該細胞來源于C57B/L6小鼠。
該細胞比較好養(yǎng)，用10%新生牛血清(國產四季清的）+RPMI1640、5%CO2、37度培養(yǎng)。重要的是無菌操作。用0.25%胰酶消化，含0.02%EDTA。消化步驟如下：棄培養(yǎng)基——用1640洗一遍——棄培養(yǎng)基----加胰酶——鏡下觀察邊晃動——細胞開始變形即可——棄胰酶-----加含血清的1640吹打———鏡下看成單細胞懸液----離心---加適量培養(yǎng)基——繼續(xù)培養(yǎng)。
【專題討論】
我和師兄一起做過神經(jīng)干細胞（NSC）的培養(yǎng)，下面談一下NSC的傳代步驟：
1.相差顯微鏡下觀察，至細胞克隆生長較為密集時，開始傳代。
2.機械分離（因為NSC是懸浮生長，可用巴氏吸管輕輕吹打細胞克隆）細胞克隆，制成單細胞懸液。
3.轉移至離心管離心，1000rpm，離心10min。
4.棄上清，加無血清NSC培養(yǎng)基DMEM/F12(1:1）重懸。
5.1：2傳代，補加培養(yǎng)基。
6.送孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。
我說一下HepG2 2.2.15細胞，它為轉染乙肝病毒的肝癌細胞，培養(yǎng)液為MEM加10%胎牛血清，1%谷氨酰胺，380ug/ml G418, 5%CO2、37度培養(yǎng),細胞生長較慢，3天傳代一次。0.3%胰酶消化，該細胞不容易消化，易抱團，我是加胰酶37度2分鐘，倒掉胰酶，將培養(yǎng)瓶倒置4分鐘再加入培養(yǎng)液，吹打重懸。
S9混合液輔助因子有哪些？
內皮細胞瓶底的數(shù)量嘍，滿了就傳代，要不然，細胞要自殺的，
細胞培養(yǎng)技術
出處：西京醫(yī)院婦產科 --醫(yī)海拾貝
一、細胞培養(yǎng)基本概念
細胞培養(yǎng)是指從體內組織取出細胞摹擬體內出現(xiàn)環(huán)境，在無菌、適當溫度及酸堿度和一定營養(yǎng)條件下，使期生長繁殖，并維持其結構和功能的一種培養(yǎng)技術。細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物為單個細胞或細胞群。
在醫(yī)學遺傳學研究中應用最廣泛的是外周血淋巴細胞、皮膚或纖維細胞和各種能在體外長期生長的細胞系。外周血淋巴細胞培養(yǎng)具有時間短、技術簡便、可重復取材等優(yōu)點，它在臨床染色體分析中使用最廣泛。體外培養(yǎng)細胞株可在培養(yǎng)過程中發(fā)生自發(fā)的或在外界作用下的轉化，成為永久細胞系，也可直接建成永久細胞系，永久細胞系能在體外無取制的傳代和生長。永久細胞系通常具有非整倍體細胞和各個細胞的核型不完全相同特征。但細胞克隆的細胞系其這一特征可以不明顯。
二、細胞培養(yǎng)的環(huán)境
細胞在體外培養(yǎng)中所需的條件與體內細胞基本相同。
1、無污染環(huán)境
培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證細胞生存的首要條件。當細胞放置于體外培養(yǎng)時，與體內相比細胞丟失了對微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質積累等，可導致細胞死亡。因此在進行培養(yǎng)中，保持細胞生存環(huán)境無污染、代謝物及時清除等，是維持細胞生存的基本條件。
2、恒定的溫度
維持培養(yǎng)細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。人體細胞培養(yǎng)的標準溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細胞對低溫的耐受力較對高溫強，溫度上升不超過39℃時，細胞代謝與溫度成正比；人體細胞在39-40℃1小時，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復；在40-41℃1小時，細胞會普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復；41-42℃1小時，細胞受到嚴重損傷，大部分細胞死亡，個別細胞仍有恢復可能；當溫度在43℃以上1小時，細胞全部死亡。
3、氣體環(huán)境
氣體是人體細胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分。開放培養(yǎng)時一般把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。
二氧化碳既是細胞代謝產物，也是細胞生長繁殖所需成分，它在細胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的PH值。大多數(shù)細胞的適宜PH為7.2-7.4，偏離這一范圍對細胞培養(yǎng)將產生有害的影響。但細胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細胞生長。有資料顯示，原代羊水細胞培養(yǎng)PH6.8時最適。
細胞培養(yǎng)液PH濃度的調節(jié)最常用的為加NaHCO3的方法，因為NaHCO3可供CO2，但二氧易于逸出，故最適用于封閉培養(yǎng)，而羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其對細胞無毒性，也起緩沖作用，有防止PH迅速變動的特性而用于開放細胞培養(yǎng)技術中，其最大優(yōu)點是在開放式培養(yǎng)或細胞觀察時能維持較恒定的PH值。
4、細胞培養(yǎng)基
培養(yǎng)是既是培養(yǎng)細胞中供給細胞營養(yǎng)和促使細胞生殖增殖的基礎物質，也是培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。培養(yǎng)基的種類很多，按其物質狀態(tài)分為半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類；按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。
（1）合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞所需物質的種類和數(shù)量嚴格配制而成的。內含碳水化合物、氨基酸、脂類、無機鹽、維生素、微量無素和細胞生長因子等。單獨使用細胞雖有生存但不能很好的生長增殖。
（2）天然培養(yǎng)基：使用最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多種細胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質。與合志培養(yǎng)基合用，能使細胞碩利增殖生長。常見使用最為5-20%。
三、細胞培養(yǎng)設施和基本條件
1、實驗室設計
細胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細胞培養(yǎng)室和設計原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。細胞培養(yǎng)工作包括：工作液配制、無菌操作（采樣）、溫育、無菌處理，細胞和用品貯存等。細胞培養(yǎng)室的設計實施原則一般是無菌操作區(qū)設在室內較少走動的內側，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一室。
2、常用設施及設備
（1）超凈工作臺：也稱凈化工作臺，分為側流式、直流式和外流式三大類。
（2）無菌操作間：一般由更衣間、緩部間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作臺及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及消毒好的無菌物品等。
（3）操作間：普通培養(yǎng)箱、離心機、水浴鍋、定時鐘、普通天平及日常分析處理物品。
（4）洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。
（5）分析間：顯微鏡、計算機及打印機等。
3、培養(yǎng)器皿
細胞培養(yǎng)以玻璃器皿為主，常準備最需是使用最的三倍。器皿應選擇透明度好、無毒、中性硬度玻璃制品。常用的玻璃器皿有下面幾種。
（1）液體儲存瓶：用于儲存各種配制好的培養(yǎng)液、血清等液體，常以500ml、250ml、100ml生理鹽水瓶或血漿瓶代替。
（2）培養(yǎng)瓶：根據(jù)培養(yǎng)細胞種類要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異，用于細胞傳代培養(yǎng)的細胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于1cm，允許吸管伸入瓶內任何部位，規(guī)格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等幾種。用于外周血培養(yǎng)的常用10ml普通圓瓶。兩種培養(yǎng)瓶均要求選用優(yōu)質玻璃制成。
（3）培養(yǎng)皿：用于開放式培養(yǎng)及其它用途。分直徑30mm、60mm、120mm等幾種。
（4）吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類，長吸管也稱刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度稱改良吸管，刻度吸管用于移動液體。常用1ml和10ml兩種。短吸管也叫滴管，分彎頭和直頭兩種。
（5）離心管：離心管是細胞培養(yǎng)中使用最廣泛的器皿，根據(jù)用途不同形態(tài)各樣，常用于細胞培養(yǎng)的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類。前者分別為50ml、30ml、15ml；后者則多為10ml和5ml。
（6）其它：如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等。
四、培養(yǎng)細胞形態(tài)
體外培養(yǎng)細胞根據(jù)它們在培養(yǎng)器皿是否能貼附于支持物上生長特征，可分為貼附型生長和懸浮型生長兩大類。貼附型細胞在培養(yǎng)時能貼附在支技物表面生長。如羊水細胞為貼附型細胞，常表現(xiàn)為成纖維型細胞和上皮細胞生長。懸浮型細胞在培養(yǎng)中懸浮生長。
1、成纖維型細胞
在培養(yǎng)中的細胞凡形態(tài)與成纖維細胞類似時，皆可稱之為成纖維細胞。本型細胞由形態(tài)與體內成纖維細胞的形態(tài)相似而得名，細胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長，細胞中央有卵園形核，胞質向外伸出2-3厘米個長短不同的突起，除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間質起源的組織細胞常呈本類形態(tài)生長。
2、上皮型細胞
此類型細胞在培養(yǎng)器皿支持物上生長具有扁平不規(guī)則多角形特征，細胞中央有園形核，細胞緊密相連單層膜樣生長。起源于內、外胚層細胞如皮膚、表皮衍生物、消化管上皮等組織細胞培養(yǎng)時，皆呈上皮型形態(tài)生長。
3、游走型細胞
本型細胞在支持物上散在生長，一般不連成片。細胞質經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動，速度快且不規(guī)則。此型細胞不很穩(wěn)定，有時亦難和其它型細胞區(qū)別。在一定的條件下，由于細胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類似多角型或成纖維細膩包形態(tài)。常見于羊水細胞培養(yǎng)的早期。
五、培養(yǎng)細胞形態(tài)分析
培養(yǎng)細胞隨貼附支持物形狀不同而形態(tài)各異，最常見的是貼附于平面支持物細胞。在一般光鏡下生存中的細胞是均質而透明的，結構不明顯。細胞在生長期常有1-2個核仁在細胞機能狀態(tài)不良時，細胞輪廓會增強，反差增大。若胞質中時而出現(xiàn)顆粒、脫滴和腔泡等，表明細胞代謝不良。
六、培養(yǎng)用品的清洗與消毒
目前我國細胞培養(yǎng)器皿主要仍使用能反復使用的玻璃器皿，清洗的主要目的為清除雜質和微生物，使在器皿內不殘留任何影響細胞生長的成份。因而在組織細胞培養(yǎng)中清洗和消毒是一項極為重要的環(huán)節(jié)。
（一） 清洗
在組織細胞培養(yǎng)中，體外細胞對任何有害物質都非常敏感。微生物產品附帶雜物，上次細胞殘留物及非營養(yǎng)成分的化學物質，均能影響培養(yǎng)細胞的生長。因此對新使用和重新使用的培養(yǎng)器皿都要嚴格徹底的清洗，且要根據(jù)器皿的組成材料不同，選擇不同的清洗方法。
1、玻璃器皿的清洗
組織細胞培養(yǎng)中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、侵酸和沖洗四個步驟。清洗后的玻璃器皿僅要求干凈透明無油跡，而且不能殘留任何物質。
（1）浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生產及運輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細胞有害的物質等。新瓶使用前應先用自來水簡單刷洗，然后用稀鹽酸液（5）浸泡過夜，以中和其中的堿性物質。再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。
（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質。刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度。
（3）浸酸：清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成，其處理過程稱為浸酸。清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質。清潔液去污能力很強。是清洗過程中關鍵的一環(huán)。浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時間一般為過夜，不應少于6小時。 清潔液可根據(jù)需要，配制成不同的強度，常用的下列三種： 重鉻酸鉀（g） 濃硫酸（ml） 蒸餾水（ml） （A）強清潔液 63 1000 200000 B）次強清洗液 120 200 1000 （C）弱清潔液 100 100 100
清潔液配制時應注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護好面部及身體裸露部分。配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產生的熱量揮發(fā)，配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產生的熱量揮發(fā)，配制溶液應選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。
（4）沖洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或潔液的殘跡。沖洗最好用洗滌裝置。即省力、效果又好。如用手工操作，則需流水沖洗十次以上，每天水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5次，晾干備用。
2、膠塞的清洗
細胞培養(yǎng)中所用的橡膠制品主要是瓶塞。新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質，應先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理，常規(guī)清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘，以除掉培養(yǎng)中的蛋白質。自來水沖洗后，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10-20分鐘，晾干備用。
3、塑料制品的清洗
塑料自制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品。必要時用2% NaOH浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。
（二）消毒
細胞培養(yǎng)的最大危險是發(fā)生培養(yǎng)物的細菌，真菌和病毒等微生物的污染，污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底，由于有關培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)的失誤均能導致培養(yǎng)失敗，故細胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)都應嚴格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染。
消毒方法分為三類： （A） 物理滅菌法（紫外線、濕熱、過渣等）。 （B） 化學滅菌法（各種化學消毒劑）。 （C） 抗生素。
（1）紫外線消毒：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進行消毒和培養(yǎng)器皿。紫外線直接照射方便、效果好，經(jīng)一定的時間照射后，可以消滅空氣中大部分細菌，培養(yǎng)室紫外線燈應距地面不超過2.5米，且消毒進物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用。
紫外線可產生臭氧，污染空氣，試劑及培養(yǎng)液都有不良影響，對人皮膚也有傷害，不宜近照射也進行實驗操作。
（2）溫熱消毒：即高壓蒸氣消毒，是一種使用最廣泛、效果最好的消毒方法。溫熱消毒時，消毒物品不能裝得過滿，以防止消毒器內氣體阻塞而千百萬危險，保證其內氣體的流通。在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內的冷空氣，冷氣空氣排出后，關閉排氣閥門，同時檢驗安全閥活動自如，繼后開始升壓，當達到所需壓力時，開始記算消毒時間。消毒過程中，操作者不能離開工作崗位，要定時檢查壓力及安全，防止消毒及表皮意外事件發(fā)生。
常用物品消毒壓力及時間：
培養(yǎng)液、橡膠制品、10磅10分鐘；
布類、玻璃制品、金屬器械、18磅20分鐘。
上兩種是最常見的物理消毒方法。
（3）化學消毒法：最常見的是70%酒精及1‰的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒?；瘜W消毒法操作簡單、方便有效。
（4）抗生素消毒：確切應記成抗生素滅菌，主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預防培養(yǎng)物污染。
七、絨毛染色體制備
絨毛來源于胚胎的中胚層，最早的初級干絨毛出現(xiàn)于孕三周初，孕8周左右是絨毛發(fā)育最旺盛時期。目前國內外絨毛取材多選于8-9周。研究資料表明，絨毛取樣不影響胚胎的發(fā)育及胎盤的功能。但取樣的失敗可導致胚胎丟失而終止妊娠。
絨毛取樣前者首先要檢查陰道分泌物以判別陰道的潔凈度，防止取樣導致宮內感染。其次需做B超檢查，一是確定胚胎大小，二是確定胚芽有無心血管搏動，三是確定胚芽在子宮內的位置，用以判別取材時間，是否取材及取樣器進宮的角度及深度。
1、 實驗材料
婦科陰道沖洗物品、絨毛取樣器、5ml注射器、培養(yǎng)皿、小鑷子、5ml離心管、甲酸、檸檬酸鈉、冰乙酸、PMRI 1640、秋水仙素、載玻片等。
2、 培養(yǎng)液配制
PRMI 1640 10-15ml
秋水仙素10ug/ml 1ml
3、 操作過程
（1）1‰新潔而滅沖洗陰道，用卵圓鉗固定子宮頸，根據(jù)婦查及B超提示選擇角度及濃度探性插入絨毛取樣器，當有彈性阻擋感且深度符合B超所示時，抽出取樣器內芯，接上5ml注射器，抽出4-5ml，此時，注射器內可見有血性液體流進；
（2）取一干凈培養(yǎng)皿，內加PRNI 1640 5ml，內含秋水仙素0.06ug/ml。慢慢抽出取樣器，將所吸出物注入培養(yǎng)皿內，并用1640沖洗注射器及取樣器，混勻。置培養(yǎng)箱30-40分鐘；（3）挑選發(fā)育良好的絨毛放入另一小培養(yǎng)皿中，用預溫37℃的0.075M。KCL與10%檸檬酸鈉1∶1混合液漂洗兩次。（4）用眼科小剪剪碎絨毛，再將2滴秋堿加入上途漂洗低滲液低滲30分鐘；（5）加3∶2的甲醇冰乙酸固定液0.2ml，預固定，1000rpm8分鐘，棄上清液；（6）加新鮮配制的3∶2固定液3ml；固定30分鐘，2000rpm8分鐘，棄上清液；（7）第二次固定可加3∶1甲醇冰乙酸固定液3ml固定30分鐘，2000rpm8分鐘，棄上清液；（8）離心后，加所余體積的60%冰乙酸，打勻，2分鐘后加等量甲醇，打勻，2000rpm8分鐘，棄上清液。（9）3m1 3∶1甲冰固定液過夜，冰水制片；（10）80℃考片2小時，自然冷卻。（11）G分帶處理，觀片。
八、羊水細胞培養(yǎng)
羊水中含有胎兒脫落的上皮細胞，可在體外培養(yǎng)用以分析胎兒染色體核型。目前國內外大都采用腹腔羊膜穿刺術，妊娠12-30周的羊水細胞均可培養(yǎng)成功。羊膜腔穿刺取羊水行染色體分析，最佳孕周為16周左右。因此時羊水增長快，羊水中細胞較多，細胞培養(yǎng)易于生長，而且不易損傷胎兒。國內多數(shù)選擇的穿刺時間在妊娠的第16-30周。國外現(xiàn)已較多地采用妊娠早期的羊膜穿刺，但需在B超下定位及穿刺。羊水量按妊娠時間大致計算（1ml/w）。資料表明，穿刺病例的妊娠結局、分娩方式、胎兒的出生體重等與未穿刺無明顯差異。
1、實驗材料
2,5%碘酒、75%酒精、無菌棉簽和棉球、鑷子、20-22號無菌腰穿針、吸管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液（PRMI 1640、199、F10、F12）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、培養(yǎng)皿、蓋玻片等。
2、培養(yǎng)液配制
F-12 85%
小牛血清 15%
雙抗 100u/ml
小瓶貯藏 4-8℃
3、操作過程
A（蓋玻片培養(yǎng)法）
（1）采樣：選擇妊娠13-14周婦女，在無菌條件下抽取羊水5ml，立即注入無菌離心管中；（2）收集：離心分離細胞，1000rpm10分鐘，去上清，留0.5ml，輕打混勻；（3）接種：30mm培養(yǎng)皿中放蓋玻片1張，每片滴混勻的細胞液1-2滴，置培養(yǎng)箱內培養(yǎng)30-60分鐘；（4）培養(yǎng)：取出后從蓋玻片外加培養(yǎng)液2ml，靜置培養(yǎng)48小時后觀察細胞生殖狀況并定時換液，5-10天后，可見大量成纖維細胞或上皮樣細胞生長；（5）終止培養(yǎng)：當有大量圓形發(fā)亮細胞出現(xiàn)時，加秋水仙素0.02-0.04ug/ml，作用10-12小時；（6）低滲：倒掉培養(yǎng)液，加預溫37℃0.075MKCL溶液5ml，37℃溫育30分鐘，鏡下可見脹大的羊水細胞，加0.5-1ml 3∶1甲醇：冰醋酸固定液預固定；（7）固定：倒掉低滲液，加5ml固定液固定30分鐘以上，反復3次；（8）干燥：將附有細胞的蓋玻片斜放于培養(yǎng)皿中，置80℃烤箱處理2-3小時；（9）膠片：將附有細胞的蓋玻片用樹脂膠封固于玻片上，正面朝外，小心細胞破壞；
B（常規(guī)培養(yǎng)法）
（1）—（2）相同于蓋玻片培養(yǎng)法；（3）接種：將混勻的羊水細胞種置于50ml或100ml細胞培養(yǎng)瓶內，平均10ml羊水細胞收集的細胞種置一瓶加5-10ml混合培養(yǎng)液。（4）培養(yǎng)：酒精燈火先封口，靜置培養(yǎng)48小時后觀察細胞貼臂及生長情況，5-10天后可見瓶底面有大量羊水細胞生長；（5）終止培養(yǎng)：同A法；（6）細胞收集：將培養(yǎng)液倒入一干凈離心管中，加0.025%的胰蛋白酶0.5-1ml/瓶，輕輕搖動，使培養(yǎng)瓶底面完全接觸消化酶，然后用彎頭吸管吹打，待細胞全部脫落后加前培養(yǎng)液終止胰蛋白酶消化。用吸管移細胞懸液于離心管中。1000-2000rpm10分鐘，棄上清，留細胞沉慮。若一次消化不徹底，可反復消化；（7）低滲及預固定：加預溫37℃KCL溶液10ml，37℃溫育30分鐘，加0.5-1ml新鮮配制的3∶1甲醇冰乙酸固定液預固定，用氣泡吹打細胞使其混勻。（8）固定：用新鮮配制的3∶2甲冰固定三次，每次30分鐘。固定液加入時沿管壁緩慢加入；（9）制片及干燥：用絨毛制片；
（10）分帶處理。
九、人外周血淋巴細胞培養(yǎng)
在正常情況下，人外周血中是沒有分裂相的，只有在異常情況下才能發(fā)現(xiàn)。植物血球凝集素（PHA）是人類淋巴細胞有絲分裂的刺激劑，在PHA作用下，原處于Go期的淋巴細胞轉化為淋巴母細胞，進而進行有絲分裂。利用PHA這一特性，淋巴細胞經(jīng)過含有HPA培養(yǎng)液培養(yǎng)，在體外便可獲得豐富的含有絲分裂的生長活躍的細胞群體，終止分裂中期的淋巴細胞，例可得到所需的人體染色體圖形。具有用血量少、操作簡單等優(yōu)點。
1、實驗材料
2.5%碘酒、75%酒精、無菌棉簽或棉球、鑷子、吸管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液（PRMI 1640、M199）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、載玻片等。
2、培養(yǎng)液配制
無菌條件下配制培養(yǎng)液，每瓶所含下列試劑：
RPMI 1640或199 90%
小牛血清 10%
PHA（自制） 0.1ml 3%
肝素 10u/ml 2%
雙抗 100u/ml（選擇）
分裝于10ml培養(yǎng)瓶內，每瓶5ml培養(yǎng)液，封口置冷藏柜備用。
3、操作過程
（1）采樣接種：用2.5%碘酒、75%酒精消毒瓶蓋，用酒精燈火焰過烤，無菌條件下抽取患者外周血0.5-1ml，每瓶加20滴左右，輕搖均勻，盡量避免培養(yǎng)物與瓶蓋接觸；（2）培養(yǎng)：置36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，每隔12小時左右輕遙1次，以促進細胞生長增殖；（3）抑止分裂：收獲前2小時左右加秋水仙素，最終濃度為0.02ug/ml培養(yǎng)液，搖勻后置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，以抑止細胞在分裂中期。（4）終止培養(yǎng)：從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，搖勻后移至10ml尖底離心管中，盡量收集培養(yǎng)細胞。2000rpm8分鐘。（5）低滲處理：棄上清液，加入預溫37℃的0.075MKCL8ml，迅速打勻，置37℃培養(yǎng)箱或水浴鍋中10-20分鐘；（6）預固定：取出低滲中尖底離心管，輕輕加入新配制的1-2ml 3∶2甲醇：冰乙酸混合液，取相應編號滴管用汽泡輕輕軟打2-3下。800-1000rpm8-10分鐘；（7）固定：棄上清液。加入新鮮配制的3∶2甲醇冰乙酸混合液10ml，輕打混勻，封口置室溫30分鐘以上。1500-2000rpm10分鐘，反復2-3次；（8）制片：使用蒸餾水制備冰水片進行滴片。留離心后沉淀細胞，加新鮮配制的固定液，制成細胞懸液，取1-2滴滴片，用于輕輕吹開?？烫柡笄謇砜烫栁畚?，置80℃烤片2小時；（9）收片：待烤箱自然冷卻后，取出烤片，置干凈環(huán)境中或培養(yǎng)箱中以備進行顯帶處理。
十、植物油凝素的制備
植物血凝素也稱為植物凝集素（PHA），可自制也可購自商品。自制的方法常用生理鹽水提取法。
（A）干品制備法（1）選廣東雞子豆10g，用蒸餾水沖洗，置培養(yǎng)皿內用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留間隙置37℃。恒溫箱內24-48小時；（2）在無菌條件下研碎雞子豆，加生理鹽水30ml，搖勻后放入4℃冰箱24小時，第二天再加生理鹽水70ml，再置4℃冰箱內24小時。每8-12小時搖蕩一次。（也可一次性加100ml生理鹽水）；（3）無菌條件下移入10-50ml離心管內，3000-4000rpm30分鐘。在無菌箱內把上清液分裝于10ml小瓶，置冰箱冷凍層備用；（4）效價：外周血染色體制備每100ml培養(yǎng)基加PHA約2ml。注：若整個過程未在無菌條件下進行，分裝時用G5玻砂漏斗除菌即可。
（B）鮮品制備法：（1）選擇完整無破皮鮮菜豆20g，用75%酒精浸泡10分鐘；（2）在凈化工作中用無菌鹽水或蒸餾水漂洗二次，然后置無菌乳缽中搗成糊狀，用100ml無菌鹽水浸泡封口；（3）移入4℃冰箱中置24小時，中間搖動數(shù)次，次日3000rpm30分鐘，在無菌情況下分裝上清液于10ml小瓶內，置冰箱冷凍層備用。（4）效價：正式使用前先用一定量作效價測定，按效價使用。
十一、組織培養(yǎng)細胞染色體制備
組織細胞用于遺傳學分析最常見的是體外培養(yǎng)的細胞株，多為惡性腫瘤細胞株，且呈貼壁生長，僅小數(shù)細胞株為懸浮生長。培養(yǎng)細胞有來源易得、細胞分裂率高和染色體標本制出清晰度高等優(yōu)點。組織細胞染色體制備的關鍵是掌握好體外細胞的生長動態(tài)，只有處在對數(shù)生長期的細胞才能出現(xiàn)較高的分裂相，所以積水仙素處理的時機及量是染色體標本形態(tài)及分裂指數(shù)的關鍵。
1、 實驗材料
培養(yǎng)液（PRMI 1640、M199、DMEM等），小牛血清、0.025%胰蛋酶、秋水仙素，刻度離心管，直吸管及彎頭吸管，培養(yǎng)瓶或皿、KCL、甲醇、冰乙酸、載玻片。
2、 培養(yǎng)液配制
培養(yǎng)液 85-95%
小牛血清 5-15%
雙抗（選擇） 100u/ml
3、 操作過程
（1）培養(yǎng)細胞：選擇處于指數(shù)生長期、用大瓶培養(yǎng)的80-90%匯合單層培養(yǎng)細胞；
（2）終止培養(yǎng)：當有大量圓形發(fā)亮細胞出現(xiàn)時，加秋水仙素0.01-0.03ug/ml培養(yǎng)混合液，置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)6-10小時以抑制分裂期細胞停止于分裂中期；（3）聚集細胞：
（A） 搖動法：
可利用分裂中期細胞變圓與底物附著不牢特點，此時可持培養(yǎng)瓶，左右反復橫向水平搖動，可使90%的中期分裂細胞從瓶壁脫落；
（B） 消化法：
將培養(yǎng)液倒入離心管內，給培養(yǎng)瓶內加0.025%胰蛋白酶液0.5-1ml/瓶，水平左右搖動，便培養(yǎng)瓶底壁面完全接觸消化酶，稍后用彎頭吸管吹打，待細胞完全脫落后，加入3-5ml前培養(yǎng)終止消化。用吸管移入裝有培養(yǎng)液的離心管內2000rpm10分鐘。棄上清液，留沉淀細胞；
（4）低滲處理：給沉淀細胞加頂溫的37℃0.075MKCL8ml左右，用吸管打均勻，在溫箱中靜置20-30分鐘；
（5）預固定：向低滲處理適當?shù)碾x心管中加新鮮配制的3∶2甲醇，冰乙醇固定液1-2ml，用吸管輕松吹打調勻，此措施能起到使細胞表面輕微固定，可防止固定后細胞粘連成塊。
（6）固定：800-1000rpm10分鐘，棄上清液加新鮮配制的3∶2甲醇冰乙酸固定液10ml，加入時要沿管壁慢慢加入，后輕輕吹打，封口后室溫靜置30分鐘以上，反復三次；
（7）制片：末次離心后，倒掉上清液，留沉淀細胞，加新鮮配制固定液0.5ml左右，混勻后冰片制片，其它同外周血方法。
十二、胸腹水細胞染色體制備
在惡性腫瘤的胸腹水中有大量的分裂期細胞，其中多以非整倍體細胞存在，并含有各種標記染色體。
1、 實驗材料
2.5%碘精、75%酒精、無菌棉球、鑷子20-22號無菌腰穿包、50ml離心管、秋水仙素、KCL、甲醇、冰乙酸、載玻片等。
2、 操作過程
（1）采樣：選擇有胸或腹水患者，在無菌條件下，輕腹穿刺或于手術取胸或腹水20-50ml；
（2）培養(yǎng)：立即加入秋水仙素培養(yǎng)，最終濃度為0.02-0.04ug/ml胸腹水，置37℃培養(yǎng)箱內4-6小時；
（3）低滲及后期制作羊水細胞。
十三、染色體制備體會
1、 培養(yǎng)基PH濃度、小牛血清量及培養(yǎng)箱溫度的恒定是培養(yǎng)成功關鍵；
2、秋水仙素適量、適宜的處理時機和時間，是獲得良好、足夠分裂相的條件。分裂相的多少和染色體形態(tài)及帶型處理良好與否均受其影響。
3、低滲處理是獲得分散良好的分裂相關鍵步驟，低滲過度或不足都會造成染色體形態(tài)不良的結果。在低滲處理時期細胞十分嬌嫩，并且表面發(fā)粘，低滲細胞混勻時，吹打要適宜，避免細胞破碎及粘團，另外不要將細胞吸到吸管上部及離心管上部，避免細胞丟失。
4、固定技術是制備良好分散的染色體的重要步驟。若染色體分數(shù)不良，可適當加大冰乙酸含量，其同時有改善由于低滲處理不夠或固定不充分所造成的缺陷，但過量會造成染色體形態(tài)變化和影響分帶結局。染色體形態(tài)不良與固定液速度有關，加第1次固定液過快或打過快，可造成飄帶樣染色體； 5、固定液每次使用必須新鮮配制，否則將會形成酯類，從而影響固定效果。6、滴片是染色體制備中影響染色體形態(tài)的關鍵一步。首先要載玻片要非常干凈，否則會影響染色體的分散和分帶效果。其次是滴片的距離、滴加量多少、制片的方式都會影響染色體分期效果。 7、烤片：是染色體制備中最后一步技術?？酒臏囟?、時間與染色體形態(tài)和分帶有關。不宜溫度過高和烤片時間過長。
十四、染色體實驗技術分析
染色體分裂指數(shù)低：患者處于非常時期（感染期、放、化療期）：
培養(yǎng)基營養(yǎng)成份不良；
培養(yǎng)基PH偏低或偏高；
PHA過量或不足；
小牛血清質量不高；
小牛血清數(shù)量偏低或過高；
培養(yǎng)溫度不穩(wěn)定；
培養(yǎng)箱溫度偏低；
秋水仙素處理時間過短；
離心時間或速度不足；
制備過程損失過大。
染色體形態(tài)不理想：受檢者處于非常時期；
PHA過量；
小牛血清質量不高；
培養(yǎng)箱溫度不恒溫；
秋水仙素量不當；
低滲時間不理想；
低滲溫度過高；
離心速度過高；
固定液加速過快；
固定混勻手法過重；
吹片技術不良。
染色體形態(tài)偏長： 培養(yǎng)基PH偏酸；
秋水仙素量偏低；
秋水仙素處理時間偏短；
染色體形態(tài)偏短： 培養(yǎng)基PH偏堿；
秋水仙紗處理量過量；
秋水仙素處理時間過長。
染色體分帶不良： 血液狀況不良；
培養(yǎng)基營養(yǎng)成分不良；
小牛血清質量不高；
小牛血清數(shù)量不當；
培養(yǎng)箱培養(yǎng)溫度不良；
秋水仙素處理量過高；
PHA量過高；
低滲處理時間或溫度不良；
胰酶質量不良；
染色液質量不良；
染色技術不良；
分帶技術不佳。
染色背景不良： 培養(yǎng)細胞生長不良；
低滲處理技術不良；
離心過程塵染；
分帶技術不良；
染色技術不良；
染色液塵染；
載玻片處理不干凈；
制片過程塵染；
存片環(huán)境不干凈。
培養(yǎng)失?。? 培養(yǎng)中損失；
血源質量不良；
培養(yǎng)中感染；
小牛血清污染；
培養(yǎng)箱溫度失控；
PHA過期或過量；
秋水仙素失效；
低滲失?。?br />
離心機失誤。
標本損失： 培養(yǎng)中損失；
制備中損失；
分帶中損失；
保存中損失；
十五、染色體分帶技術
染色體顯帶技術是在顯示染色體基礎上發(fā)展起來的技術，其優(yōu)點是能顯現(xiàn)染色體本身更細微的結構，有助于更準確地識別每條染色體及染色體異常疾病。染色體分帶技術能適用于各種細胞染色體標本。
染色體顯帶是沿著整條染色體的長軸，能顯現(xiàn)出著色深淺不同、橫向走的帶型。目前認為染色體顯帶現(xiàn)象是染色體結構所致。但用特殊方法處理后，再用染料染色，則帶型更加清晰，隨顯帶方法不同，顯現(xiàn)出的帶型的特點也不一樣，這說明帶的出現(xiàn)與染料的特異結合相關。人類染色體能顯現(xiàn)出近2000個G帶，這些帶再融合成一般顯微鏡下可見的850條左右的高分辯染色體帶型或350條帶左右的常規(guī)帶型。
常見的幾咱顯帶方法：
（一）、G帶
也稱為G顯帶，是最常用的顯帶方法，具有操作簡便、經(jīng)濟及標本能長期保存等優(yōu)點。
1、Giemsa原液的配制：
（1）稱3.75gGiemsa粉置研磨器中，加少許丙三醇研磨，研磨越細越好；
（2）將研細的Giemsa加丙三醇移入500ml棕色瓶內，丙三醇的總量為250ml，用一定量甲醇洗干凈研磨器。
（3）搖勻，置60℃水浴鍋24小時或37℃溫箱72小時，經(jīng)常搖動。
（4）取出冷卻后，加甲醇總量至250ml混勻，密封棕色瓶備用。貯藏時間越長，染色效果越好。
2、實驗材料：
中期染色體標本；
0.9%氯化鈉注射水；
3%tris液體；
0.25%胰蛋白酶；
Gremsa染色液；
蒸餾水；
水浴鍋；
立式染缸；
定時器或時針；
溫度計；
鑷子及紗布；
刻字筆；
3、操作程序：
（1）消化液配制：取0.9%氯化鈉注射水100ml，加0.25%胰蛋白酶1ml，制成0.025%胰蛋白酶鹽水消化液，加4-5滴tris液調PH6.8左右，移消化液于立式染色缸并置37℃水浴鍋中備用；
（2）染液配制：取立式染缸，加蒸餾水500ml，加3滴tris液調PH并加入Giemea染液1ml左右，用吸管調勻備用；
（3）漂洗液：取立式染缸一個，內加蒸餾水備用；
（4）試消化：待消化液溫度在37℃左右時，取同批標本較多者標本1張，分二節(jié)或三節(jié)進行消化，每節(jié)相差十五秒左右，從45秒或60秒開始增減。取出后先在紗布或吸水紙上直立除去帶出胰蛋白酶，后置蒸餾水染缸內漂洗，取出后，標本斜面朝上，刮去染色缸內染液上浮膜，沿槽插入，每分鐘移動1次，染色3-5分鐘。
（5）洗片：從染色缸中取出標本玻片，自來水沖洗，取刻編號面朝上用紗布干凈玻片背部染色，稍干，高倍鏡下觀片，確定分帶與染色時間。
（6）分帶：取4張待分帶標本玻片，細胞面朝左側按順序插入37℃的消化液中，消化時間較試消化選擇時間延長5-10秒鐘，取出每片間隔時間約10秒鐘左右。
（7）消化及染色調整：每次消化完一批標本后，需加入配好的消化液25ml于消化缸中，下次消化時間不變。同樣，每次染色一批標本后加Giemsa染色液2-3滴，調勻，每次染色時間不變；
（8）Giemsa染色調整：若Giemsa染色標本偏紅，說明染色液偏酸，可加tris數(shù)滴調藍，若Gremsa染色標本偏藍則說明tris加多了；
（9）保存：將分好帶的及觀察中的標本及時收集于玻片盒內保存，防止細胞涂面灰塵污染及擦損。
注意：Giemsa消化染色過程中，有兩個重要的環(huán)節(jié)，一是胰酶消化環(huán)節(jié)，消化不足帶不出現(xiàn)，消化過度染色體變得膨脹和不著色，必須把握好胰酶濃度、消化時間和消化溫度；二是預處理或老化環(huán)節(jié)，對消化和帶型清晰度有很大影響，其中80℃2小時熱處理，是簡便易行和效果較好的辦法。
（二）姐妹染色單體分化染色
姐妹染色單體差別染色可使中期染色體顯示深淺不同的兩條單體，能借以觀察姐妹染色單體互換（SCE）現(xiàn)象。SCE是兩條染色單體在DNA合成中核苷酸序列發(fā)生互換而表現(xiàn)出來一種現(xiàn)象。即是細胞分裂是DNA同源重組的結果。SCE既是一種無害的變化（有生理波動），也可受射線、致突和致癌物三因素等作用而升高。SCE一定成度反映細胞的損傷與修復狀態(tài)。
1、原理：
在細胞培養(yǎng)過程中，加入一定是的5-溴脫氧尿苷（BudR ）,當細胞在DNA復制過程時，BudR能作為核苷酸的前體取代胸腺嘧啶而被摻入到新合DNA中。因此，當細胞處于第二個分裂周期時，同一染色體的兩條姐妹染色單體，一條由雙股都含有BudR的DNA鏈構成，而另一條為單股含有BudR的DNA鏈。在結構上雙股含BudR的DNA螺旋化程度較低，故對染色劑親合力低，在用Giemsa染色時其單體著色淺，只有單股含BudR的DNA鏈組成的單體則著色深而形成差別著色。
2、BudR貯存液的配制：
BudR 5mg（先用0.5ml 1N NaOH溶解）
然后加蒸餾水至 5ml
即成1000ug/ml的貯存液，因BudR遇光會發(fā)生分解，貯存液需置棕色瓶并黑紙封瓶避光冰凍保存。
3、實驗材料：
所檢培養(yǎng)細胞；
BudR貯存液；
2×SSC液；
常規(guī)染色體制片所需物品；
水浴鍋；
20W紫外燈一個；
培養(yǎng)皿；
鏡頭紙；
4、操作程序
（1）BudR摻入：細胞培養(yǎng)24小時后于培養(yǎng)液中加入BudR，最終濃度5-15mg/ml，避光條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
（2）終止培養(yǎng)：待細胞經(jīng)歷兩個細胞周期（48小時），培養(yǎng)終止前3小時加秋水仙素，秋水仙素終濃度為0.02ug/ml培養(yǎng)液；
（3）常規(guī)制片及烤片；
（4）紫外燈照射：取標本玻片置于大號培養(yǎng)皿內，正面朝上，上覆蓋鏡頭紙，從玻片外鏡頭紙邊沿加2×SSC液致使全鏡頭紙浸濕，移入50-60℃水浴鍋內，紫外線燈距離5cm，照射30-40分鐘；
（5）染色：取出照射后標本，蒸餾水沖洗，置PH6.8的2%Giemsa染色15分鐘；
（6）洗片及存片：同G帶片
注意：BudR是一種強突變劑，使用濃度不宜過高，否則會產生細胞毒性作用。
（三）染色體脆性部位（fra）
脆性位點也稱危性部位，是在一定的培養(yǎng)條件下人類染色體上某些特異位點非隨機地表現(xiàn)出的裂隙和斷裂。脆性部位分為普通型和罕見型兩大類。
1、實驗材料
（1）常規(guī)外周血所用物品。
（2）培養(yǎng)基是用不含葉酸的MEM-Fra培養(yǎng)基或低葉酸的CT199培養(yǎng)基。
2、培養(yǎng)液配制
MEM-Fra 90-95%
小牛血清 5-10%
雙抗 100u/ml
PH調至7.5左右
3、操作程序
與制備外周血的染色體方法相同。
注：脆性X綜合癥：（FraX）
這種染色體改變是在1969年被發(fā)現(xiàn)，1977年被定位于Xq27、記錄為fra（X）（q），并命名為脆性部位。X連鎖智力低下（MR）與fra（X）（q27）密切相關。FraX的發(fā)生率占新生兒的1/2500；占X連鎖MR病1/2-1/3；占男性MR的1-2%；其發(fā)生率僅次于先天愚型
我也來說說，我培養(yǎng)的是人骨髓基質細胞，原代時間較長，關于胰酶與EDTA比例的問題，我們實驗室有兩種做法，一個是1：1地加入，另一個是保證胰酶中濃度0.25，EDTA終濃度0.02（混合液中）
LONZA特殊無血清培養(yǎng)基 （點擊進入）
詳情煩下載附件
|
