其實這個東西分子克隆上寫得很清楚，照著走應(yīng)該是可以出結(jié)果的。但現(xiàn)在許多人不看書，只上網(wǎng)。
脈沖場凝膠電泳（PFGE）的原理大致為:
細菌包埋于瓊脂塊中,用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶在原位對整個細菌染色體進行酶切,酶切片段在特定的電泳系統(tǒng)中通過電場方向不斷交替變換及合適的脈沖時間等條件下而得到良好的分離。
ＰＦＧＥ中內(nèi)切酶的選用至關(guān)重要,所采用的內(nèi)切酶常為寡切點酶(ｌｏｗｆｒｅｑｕｅｎｃｙｃｌｅａｖａｇｅｒｅｓｔｒｉｃ-ｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ),這種酶切后的片段少而大,適合于作ＰＦＧＥ電泳。ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ等[8]通過對細菌的ＰＦＧＥ電泳圖譜的內(nèi)切酶的選擇研究發(fā)現(xiàn),四核苷酸ＣＴＡＧ在許多ＧＣ含量>45%的細菌染色體中是很少見的,在他們所試驗的16個細菌的染色體中,被1個或多個可識別ＣＴＡＧ位點的內(nèi)切酶酶切,每100000ｂｐｓ中不到一次,這些酶的識別序列分別為:ＸｂａⅠ(ＴＣＴＡＧＡ),ＳｅｐⅠ(ＡＣＴＡＧＴ),ＡｖｒⅡ(ＣＣＴＡＧＧ)和ＮｈｅⅠ(ＧＣＴＡＧＣ)。同樣地,在許多含Ｇ+Ｃ<45%的基因組,ＣＣＧ和ＣＧＧ更少。這樣用ＳｍａⅠ(ＣＣＣＧＧＧ)、ＲｓｒⅡ(ＣＧＧＷＣＣＧ)、ＮａｅⅠ(ＧＣＣＧＧＣ)和ＳａｃⅡ(ＣＣＧＣＧＧ)進行酶切,對產(chǎn)生平均超過100000ｂｐｓ片段是非常合適的。
對ＰＦＧＥ結(jié)果的觀察,可因不同研究者而出現(xiàn)較大差異,據(jù)此,Ｔｅｎｏｖｅｒ等[6]經(jīng)過多年的研究提出了ＰＦＧＥ的解釋標(biāo)準(zhǔn):(1)相同(ｉｎｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｅ):酶切圖譜間有同樣的條帶數(shù),且相應(yīng)條帶大小相同,流行病學(xué)上則認為相同,這種經(jīng)ＰＦＧＥ證實的結(jié)果,用其它方法檢測不可能顯示實質(zhì)性的差異。(2)緊密相關(guān)(ｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄ):ＰＦＧＥ試驗中,其它克隆株與暴發(fā)克隆株有一致的單一基因事件的改變,如點突變、插入或ＤＮＡ缺失。典型的情況下,這種變化可導(dǎo)致2～3條帶的差異,當(dāng)一些分離菌株被多次重復(fù)培養(yǎng)或自同一病人多次分離時可觀察到這種現(xiàn)象。(3)可能相關(guān)(ｐｏｓｓｉｂｌｙｒｅｌａｔｅｄ):兩個獨立的基因情況所致的一致的差異,如出現(xiàn)了4～6條帶差異,此時能用簡單的插入或ＤＮＡ缺失或限制性位點的獲得或缺失來解釋。這些菌株與暴發(fā)株間遺傳基因不緊密相關(guān),流行病學(xué)上也不大可能相關(guān),在長于6個月時間及大范圍的暴發(fā)中收集的菌株可出現(xiàn)這類情況。(4)不相關(guān)(ｕｎｒｅｌａｔｅｄ):1個分離菌株通過3個更多個獨立的基因事件所致的一致的改變,其ＰＦＧＥ圖譜與暴發(fā)克隆株樣式不同,則可認為與暴發(fā)克隆株不相關(guān)(一般總有7個或更多個條帶的差異)。典型情況下,這一分離株常只有少于50%的良好的分離的片段出現(xiàn)在暴發(fā)株圖譜樣式中。 |
